中草药饲料添加剂发酵菌种的筛选与发酵条件研究

中草药饲料添加剂发酵菌种的筛选与发酵条件研究中草药饲料添加剂属于天然药物，大量研究表明，中草药饲料添加剂具有促进动物生长发育、提高饲料利用率、改善畜禽产品质量、增强动物免疫功能等作用（李洪龙等，2007；刘根新等，2007；王丽辉等，2007；李宗辉等，2002；唐建安等，2000），其研究和应用已受到国内外研究工作者的广泛关注。但由于中草药饲料添加剂的应用和研究存在用药成分复杂、含量低、适口性差、效果不稳定、用量大且难以掌握、毒副作用等问题，阻碍了中草药饲料添加剂的规模化推广应用。微生物发酵中草药饲料添加剂是利用微生物的降解作用，将中草药中的有效成分、活性物质最大限度地释放出来，并对中草药活性成分进行修饰产生新的活性物质。微生物在生长代谢过程中，可以产生各种各样的防病助生长的次生代谢产物，可将动物难以消化吸收的大分子物质转化成易于吸收的小分子物质，还可产生各种不同的酶，从而促进动物生长发育，缩短饲养周期，提高饲料报酬率，增强药效和降低饲养成本等。本文采用从不同中草药中分离能够发酵中草药的微生物，对中草药复中草药饲料添加剂发酵菌种的筛选与发酵条件研究湖南农业大学生物科学技术学院兰时乐李立恒胡超林元山谢达平[摘要]为提高中草药饲料添加剂的抑菌效果和应用效果，从中草药青蒿、鱼腥草、地骨皮、黄岑、胆草、夏枯草等中草药中筛选到1株能发酵中草药饲料添加剂的菌株，鉴定为米曲霉Y-1。以抗菌活性和CMCase酶、FPA酶及蛋白酶酶活为评价指标，研究了以青蒿、鱼腥草、地骨皮、胆草等为主组成的中草药饲料添加剂的发酵条件。结果表明，合适的发酵条件为：中草药饲料添加剂与麦麸的比例为7∶3、葡萄糖1%、发酵温度32℃、初始pH自然、物料含水量50%～60%、发酵周期为72h。在此条件下，发酵料蒸煮液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌活性分别较对照提高36.03%、60.83%、27.64%、41.32%，CMCase、FPA酶和蛋白酶酶活分别达到9653、971U/g和6357U/g。说明中草药饲料添加剂通过微生物发酵可提高其作用效果。[关键词]中草药；饲料；饲料添加剂；发酵条件[中图分类号]S816.7[文献标识码]A[文章编号]1004-3314（2010）15-0013-05[Abstract]ToimprovetheeffectsofantibacterialandapplicationofChineseherbalfeedadditive.AChineseherbalfeedadditivefermentingstrainwasisolatedfromChineseherbalsuchasHerbaartemisiaeannuae，Herbahouttuyniae，CortexLycii，ScutellariabaicalensisGeorgi，CorallodiscusflabellateandSpicaprunellaeetc.ItwaspreliminarilyidentifiedasAspergillusorzymeY-1.ThefermentationconditionsforChineseherbalfeedadditivecontainingHerbaartemisiaean-nuae，Herbahouttuyniae，CortexLycii，CorallodiscusflabellatewerestudiedwiththeantibacterialactivitiesandCMCaseactivity，FPAactivity，proteinaseactivityastheindexesofevaluation.Theresultsshowedthattheoptimalfermentationconditionswere：theratioofChineseherbalfeedadditivetowheat-branwas7∶3，glucosewas1%，fermentationtempera-turewas32℃，initialpHwasnature，watercontentwas50%～60%，fermentationtimewas72h.Underthesecondi-tions，theantibacterialactivitiesofthefermentedproductswereenhanced36.03%，60.83%，27.64%，41.32%againstEscherichiacoli，Saphylococcusaureus，Proteusvulgaris，Salmonellatyhimuriumthanthecomparison.CMCaseactivity，FPAactivityandtheproteinaseactivitywererespectivelyachieved9653，971U/gand6357U/g.TheresultsindicatedthattheeffectsofChineseherbalfeedadditivecouldimprovebymicrobialfermentation.[Keywords]Chineseherb；feed；feedadditive；fermentationcondition!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!13中国饲料2010年第15期方进行发酵，并测定了中草药复方发酵前后抑菌活性和纤维素酶、酸性蛋白酶活力的变化规律，以期为开发发酵型中草药饲料添加剂提供依据。1材料与方法1.1材料中药：青蒿、鱼腥草、地骨皮、黄岑、贯众、胆草、石菖蒲、夏枯草、紫草、金银花、板蓝根等中草药，购于长沙市汽车东站中药材市场，无霉变和虫蛀。低温烘干，粉碎后，过40目筛，备用。供试菌株：大肠杆菌（Escherichiacoli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）、普通变形杆菌（Proteusvulgaris）。1.2培养基1.2.1中草药饲料添加剂浸煮液的制备称取适量的中草药饲料添加剂复方，加入20倍的蒸馏水，煎煮30min后粗过滤，取滤液于8000r/min离心15min，取上清液，减压浓缩5倍，备用。1.2.2细菌分离培养基牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，中草药饲料添加剂水煮液5%，琼脂粉1.5%，pH7.2～7.5。1.2.3霉菌分离培养基马丁氏固体培养基（沈萍和陈向东，2007）中加入0.8%去氧胆酸钠和5%中草药饲料添加剂水煮液，pH自然。1.2.4液体种子培养基葡萄糖5%，豆饼粉1.5%，酵母粉0.5%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O0.1%，CaCO30.4%。1.2.5发酵培养基中草药饲料添加剂复方90%，麦麸5%，葡萄糖3%，（NH4）2SO41.5%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O0.2%。1.3方法1.3.1中草药饲料添加剂发酵菌种筛选分别称取10g粉碎至40目的青蒿、鱼腥草、地骨皮、黄岑、贯众、胆草、石菖蒲、夏枯草等不同中草药于90mL带有玻璃珠的无菌水中，振荡15min后，适当稀释。分别取0.1mL不同稀释度的中草药稀释液于细菌和霉菌分离培养基平板中央，涂布均匀。细菌平板在37℃培养48h，霉菌平板在28℃恒温培养3～5d进行初筛。将初筛得到的菌株采用平板划线法分离纯化后，分别接种于加有20%中草药饲料添加剂浸煮液的细菌和霉菌培养基中进行复筛，将复筛得到的菌株于4℃冰箱中保存待用。1.3.2培养菌种活化：将供试菌株和Y-1接种于牛肉膏蛋白胨和PDA培养基斜面上，分别置于37℃和28℃恒温培养箱中培养48～72h，备用。液体种子培养：将培养成熟的斜面菌种Y-1接种于液体种子培养基中，28℃，180r/min条件下培养72h。中草药饲料添加剂的发酵：按配方称取中草药饲料添加剂发酵培养基30g于250mL三角瓶中，自来水调节含水量50%，充分拌匀，110℃灭菌30min后，按10%（V/m）的接种量接种培养好的液体种子，28℃培养96h，50℃烘干。同时以接种无菌水为对照。1.3.3发酵条件的研究培养方法同1.3.2，替换不同的条件，如中药与麦麸的不同比例、碳源的种类、氮源的含量、起始pH值、含水量、温度等，考察Y-1霉菌发酵中草药饲料添加剂后对抑菌效果的影响及Y-1霉菌的产酶规律。1.3.4抑菌试验及酶活测定发酵样品处理：称取10g不同菌种的发酵物和各组对照物，加入200mL蒸馏水，煮沸15min后，3000r/min离心15min，收集上清液，残渣加入200mL蒸馏水提取后，离心，合并上清液，真空减压浓缩至每毫升含1g生药。抑菌试验：取培养16～18h的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏菌新鲜培养液5mL，分别加入100mL冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基中，混合均匀后，在直径为9cm的标准培养皿中准确吸入15mL含菌培养基，冷却成含菌平板。每个平板上放置3个灭菌的牛津杯，牛津杯中加入40μL中草药饲料添加剂发酵浸提液。37℃培养24h，测定抑菌圈的大小。每处理设3次重复。同时以未接种的为对照。酶活测定：（1）粗酶液制备：称取经低温烘干的固体中草药发酵剂1.00g于100mLpH4.8的磷酸缓冲液中，40℃浸提2h，滤纸过滤，4000r/min离心15min，4℃冰箱保存备用。（2）纤维素酶活力测定：参照Vallander和Erik（1985）提供的方法并略作修改进行测定。（3）羧甲基纤维素酶（CMCase）活力测定：于25mL具塞试管中加入浓度为1%CMC-Na-醋酸缓冲液（pH4.8）1.8mL，加入0.2mL粗酶液，50℃保温30min后，加入142010年第15期中国饲料3.0mLDNS试剂，水浴煮沸5min，冷却后用蒸馏水定容，摇匀，于540nm处测定光密度值。酶活定义：在反应条件下，30min水解羧甲基纤维素钠产生1mg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位（U）；（4）FPA活力测定：于25mL具塞试管中加入pH4.8的醋酸缓冲液1.8mL、新华滤纸50.0mg以及酶液0.2mL，50℃保温60min后，加入3.0mLDNS试剂，其他同CMCase酶活测定。酶活定义：在反应条件下，每60min水解滤纸产生1mg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位（U）。（5）酸性蛋白酶活力测定：参照姜锡（1999）提供的方法进行测定。2结果与分析2.1中草药饲料添加剂发酵菌种的筛选从青蒿、鱼腥草、地骨皮、黄岑、贯众、胆草、石菖蒲、夏枯草等中草药中共分离出22株微生物菌株，其中细菌14株，霉菌8株。将纯化的菌株点种在含药浓度逐步递增的固体培养基平板上，通过多次反复筛选，得到一株在中药复方中生长良好、发酵能力较强的菌株，初步鉴定为米曲霉Y-1。2.2中草药饲料添加剂与麦麸比例对Y-1霉菌产酶的影响及抑菌效果的影响分别配制中药与麦麸不同比例（9∶1、8∶2、7∶3、6∶4）的发酵培养基，按10%（V/W）接种量接种Y-1种子培养液，28℃恒温培养72h，测定酶活，同时提取发酵液进行抑菌实验，结果见表1、图1。从表1可以看出，中草药饲料添加剂中添不同比例的麦麸发酵后对四种供试菌的抑菌效果都有不同程度的增加。当中草药饲料添加剂与麦麸的比例为7∶3时，发酵物料的蒸煮液对S.aureus、S.tyhimurium、E.coli、P.vulgaris的抑菌效果分别增加38.61%、22.32%、27.93%和11.4%。从产酶效果来看（如图1），在一定范围内，随着麦麸比例的增加，纤维素酶的活力增强，当中草药饲料添加剂与麦麸的比例为7∶3时，CMCase酶活达9870U/g，FPA酶活为892U/g，主要原因为中草药中含有大量的纤维素