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（4）洗脱：开启输液泵，按适当流速输入展开剂。（5）收集：按一定ml数或依据色带（可见或紫外）分部收集。（6）鉴定：洗脱液TLC鉴定，相同斑点合并，浓缩结晶。4、例（P137）人参叶提取物经硅胶柱层析分离后，得到收集流份，某流份经TLC检查，出现4个斑点。此混合物250mg溶于1ml展开剂及2ml乙醇中展开剂：n-BuOH：CHCl3：MeOH：H2O（40：20：15：20），流速为1.7ml/min。TLC板：硅胶GF25435g+0.5CMC-Na75ml，90。C活化3h收集流份25份（5~6ml/份）：流份5——人参皂苷Rb2流份9~11——人参皂苷Rc流份15~17——20-glc人参皂苷Rf流份19~23——人参皂苷Rd（六）离心液相色谱法（CLC）CLC是在离心TLC的基础上发展起来的一种制备分离技术。1、特点a)不用预制板，制板体积固定。b)载量大，厚度可达1cm，厚度均匀，分离效果好，制备量大于CTLC。c)填充剂可用多种分离材料：硅胶、氧化铝、聚酰胺、凝胶、离子交换树脂。扩大了使用范围。d)与柱层相比，因引进了离心，所以分离速度快，效果好。2、仪器（1）控制器：调节转速（由此控制流速），分离时间，收集时间。（2）洗脱器：进样，注入展开剂。有进样通道，展开通道。（3）分离盘：由底盘、垫圈、盘盖、柱芯、旋盖组成，由垫圈的不同规格，控制装填厚度。注入吸附剂，在离心作用下，圆盘封闭体系内逐渐被分离材料充满，形成一定厚度的平整涂层。（4）分部收集器3、操作（1）制备填充剂硅胶填料的用量垫圈规格防漏层硅胶（g）铺板用硅胶（g）调糊用溶剂（ml）3mm8804505mm1212060010mm161601000（2）填装防漏层（3）装填填充剂（4）进样、洗脱（5）收集、鉴定：分部收集器收集，TLC鉴定，洗脱液处理同常法。4、实例（P141）红秦艽MeOH提取物，上样量200mg，60g硅胶G制板，板厚2mm，转速300转/min。展开剂Pet：四氢呋喃：MeOH（100：10：3），分离时间1h，得丹参酮IIA，丹参酸甲酯，丹参酮I。（七）电泳1937年开始，现在中药成分研究中，成功地用于生物碱、有机酸、氨基酸、蛋白质的分离、鉴定。1、原理带电荷的化合物在电场作用下产生定向移动，由于混合物中各组分所带电荷性质（+、—）、数量、强度及分子量不同，各组分移动的方向及速度均不相同，从而达到分离。2、电泳速度的影响因素电泳速度cm2/秒/伏=电子迁移率a、分子的性质，离子态，电泳速度快。极性基团多，电泳速度快，在电场作用下，发生极化，产生电性。b、电场强度（电位降/cm），电场强度高，电泳速度快。c、溶液离子强度：介质（缓冲液），离子强度高，成分移动慢。d、电渗（液体对于支持体的相对移动）支持物的极性基团在电场作用下产生电性，支持物上的溶液产生相反的电性，这样，影响到各个组分的电泳速度。此外，缓冲液黏度、温度也有一定的影响。3、纸电泳（简单、易行）（1）装置：稳压器，电极，缓冲液槽（2）缓冲液的选择：离子强度0.02~0.2，控制电泳速度恒定。（3）点样：点状或带状，点在滤纸中央。点样后纸两端浸入缓冲液，至距样品4~5cm取出，让缓冲液扩散至样品。（4）电泳：点好样的滤纸放在支架上，二端下垂浸入缓冲液槽中，通电流。一般电场强度为10伏/cm，电泳2h（5）显色：同一般PC（6）作用：了解各组分酸碱性及强弱，再针对性地提取、分离。纸电泳谱位及判断缓冲液正极负极结果判断酸性缓冲液▓中性成分碱性缓冲液▓酸性缓冲液▓中性成分碱性缓冲液▓酸性缓冲液▓弱碱性成分碱性缓冲液▓酸性缓冲液▓强碱性成分碱性缓冲液▓酸性缓冲液▓弱酸性成分碱性缓冲液▓酸性缓冲液▓强酸性成分碱性缓冲液▓酸性缓冲液▓两性成分碱性缓冲液▓4、琼脂板电泳以琼脂板为支持物的一种凝胶电泳。制板点样电泳染色常用于分离测定蛋白质，因为琼脂对蛋白质吸附极微。三、柱层析法分离原理同平面层析，不同在于将分离材料加入玻璃柱中，再洗脱分离。分离样品量大，0.1~50g，多为制备性分离。吸附柱层分配柱层离子交换柱层凝胶带柱层（一）氧化铝、硅胶吸附柱层氧化铝——生物碱、挥发油、内酯、甾体等亲脂性成分。硅胶——亲脂性、亲水性化合物分离，亦可用于分配。程序：装柱上样洗脱鉴定1、装柱样品：吸附剂Al2O31:20~50（极性小的可1:100）SiO21:30~100（极性相近的可1:300~400）层析柱规格1:10~30（直径:高度）原则：均匀、致密，无气泡、缝隙。(1)干法装柱：底部塞脱脂棉，敲击，顿击。(2)湿法装柱：倒入溶剂后，加吸附剂；吸附剂+溶剂搅拌后，倒入柱中2、上样a样品+展开剂溶液、上样，（注意：柱床表面防冲击）b样品+易溶溶剂溶液+少量吸附剂拌匀、干燥、过筛装于干柱顶端装于（上端留有一定体积溶剂）湿柱溶剂中3、洗脱洗脱液由TLC摸索确定常用梯度洗脱法：eg、Pet-EtOAC、CHCl3-MeOH注意：少用OH-、H+、三相溶剂分部收集洗脱液、体积小、组分交叉少、但后处理麻烦a体积大、组分交叉多、但后处理便利ba用于Rf值差异小、or单体纯化b用于Rf值差异大、粗分常根据上样量、柱子大小、分离度好坏来决定2、鉴定TLC、PC荧光检测、微生物活性显示相同组分合并、浓缩后析晶，结晶法如前述5、实例，粉防己中汉防己甲、乙素的分离P153OCH3CH3OCH3ORCH3H3CONNOO汉防己甲素R=CH3汉防己乙素R=H汉防己根粗粉200g+95%EtOH1400ml回流3次滤液浓缩至糖浆状残渣50`C+1%HCl300ml边加边搅滤液环乙烷:EtOAC(1:3)萃取2次有机层水层+NH4OHpH=9环乙烷：EtOAC(1:3)有机层水层无水Na2SO4脱水，蒸干抽松，Me2CO结晶总碱硅胶柱层，加压：0.5~0.6Kg/cm2环乙烷:ETOAC:二乙烷(6:2:1)洗脱流速0.7~0.8ml/min汉防己甲素汉防己乙素（二）聚酰胺柱层析1、分离原理(1)氢键吸附（60年代初形成）CHCHCHCHCHCHCHCHCHN-HO=CH-NC=OCHN-HCHCHCHCH22222222O=CC=OH-N222222H-OOO醌类、硝基类酚类、酸类聚酰胺化合物①溶剂洗脱难易：水MeOHEtOHMe2CO稀NH3OH稀NaOH在水中形成氢键能力最强，在有机溶剂中较弱，在碱性溶液中最弱。②成分吸附难易:a形成氢键基团多、吸附力强eg：COOH-CH2-CH2-COOHCH3CH2CH2COOHOHOHOHOHOHHOb对、间位酚OH邻位酚OHOHOHOHOHOHOHOHc芳香核、共轭双键多、吸附力强OHOHOHd形成分子内氢键、吸附力弱OHHOOHCOOHCO（2）极性吸附原理，（双重层析性能：氢键+极性吸附）既有酰胺基，又有非极性脂肪链Ⅰ适于难与聚酰胺形成氢键的：萜类、甾体、生物碱Ⅱ适于以非水性有机溶剂为洗脱剂，如CHCl3:MeOH如黄酮苷(A)、相应的黄酮苷元(B)含水溶剂洗脱（含水醇）：AB（水中氢键牢固，且对苷溶解性大）非水溶剂洗脱（如CHCl3-MeOH）：BA（极性吸附原理）2、聚酰胺的制备与再生：制备：市售聚酰胺（15~30目+H20，浸12~24h研磨过筛（80~100目）混悬液装柱抽滤60-80`C，2-3h备用再生：5%NaOH洗至无色，水洗中性含多元酚液（鞣质）+5%NaOH浸泡过夜换5%NaOH反复数次水洗至pH=92倍10%HAC洗水洗中性3、柱层操作：①装柱：混悬液直接装柱，自然沉降，水与柱床表面齐平即可。细粉+H2O搅拌至气泡除去装柱，同上②加样：20~30%样品水液样品：聚酰胺=1：40~60a、除杂，样品量可大大增加b、样品不溶于水，可用少量醇溶后，拌入少量聚酰胺粉，挥去溶剂，悬浮于洗脱剂中上样③洗脱：一般H2O10%EtOH30%EtOH50%EtOH70%EtOH95%EtOH3%NH4OH5%NaOH......梯度更换，根据洗脱液颜色掌握④鉴定：TLC检索，相同流份合并，浓缩后适当溶剂结晶4、实例甘草叶中黄酮类成分的提取分离甘草叶1050g+95%EtOH渗漉乙醇提取液残渣回收EtOH后，Pet萃取有机层水层+175g硅胶拌匀，MeOH：H2O（7：3）洗脱洗脱液浓缩依次用CHCl3、EtOAC、n-BuOH萃取CHCl3液EtOAC液n-BuOH液浓缩总黄酮17g聚酰胺干柱层析CHCl3：MeOH（6：1）展开，切割，MeOH洗脱A部分3.5gB部分1.5gC部分聚酰胺干柱层析聚酰胺柱层析MeOH-H2O重结晶CHCl3：MeOH（6：1）展开CHCl3：MeOH（1：2）洗脱SephadexLH-20纯化naouralenol100mgⅠⅡⅢⅣⅤUralenol50mg聚酰胺柱层析CHCl3：MeOH梯度洗脱晶Ⅳ50mgUralenin250mg（三）炭柱层析法价廉，吸附力大，适用于大量制备分离。1、原理—非极性吸附对非极性化合物吸附力强对极性化合物吸附力弱规律：a在极性大的水中吸附力强在极性小的有机溶剂中吸附力弱所以，一般以不同梯度含水有机溶剂洗脱，极性大小b化合物极性基团（-COOH，NH2，OH...）多，吸附力弱极性基团少，吸附力强c化合物母核大，吸附力强；反之，吸附力弱。所以，吸附力：多糖低聚糖单糖多肽氨基酸d吸附力：芳香族脂肪族e吸附力：生物碱：碱水液中酸水液中（离子态，极性大）有机酸、酚类：酸水液中碱水液中（离子态，极性大）f一般用于水溶性化合物：氨基酸、单糖、多糖、苷类…2、活性炭的处理特点：易吸附空气，气体占据吸附表面，俗称“中毒”，所以用前一般需要活化（120~150。C活化2~6小时），锦纶活性炭80。C活化数小时（高温变形）。3、操作（1）装柱：水中，同聚酰胺粉状活性炭+硅藻土（1：1）（增加流速），再以蒸馏水混悬，装柱。（2）上样：20~40%样品水液；不溶样品醇溶后上样。上样量：样品：活性炭=1：10~20（3）洗脱、鉴定：同聚酰胺4、实例：人参中糖类成分分离人参根100g2+水提取提取液残渣+EtOH放置沉淀滤液50℃以下减压浓缩糖浆状液H2O5%EtOH15%EtOH20%EtOH30%EtOH洗脱液洗脱液洗脱液洗脱液洗脱液减压浓缩葡萄糖及果糖浓缩液三糖四糖更高寡糖通过AmberliteIRl20、IR45离子交换树脂脱盐溶液纤维素柱层析异丙醇∶丙酮∶水（40∶42∶18）蔗糖蔗糖麦芽糖（含少量麦芽糖）（四）分配柱层1、原理样品随流动相通过含有固定相填料的层析柱时，成分在固定相—流动相之间不断分配，而达到分离。分配系数差异越大，越易分离。2、支持剂a、中性多孔性粉末。b、化学惰性，不溶于固定相、移动相。c、能吸附相当量的固定相，且流动相能自由通过。如：硅藻土、纤维素、硅胶……3、溶剂系统选择文献记载（PC）预试（分配TLC或PC）4、操作（1）装柱a支持剂+固定相（流动相已饱和）搅匀抽滤吸附了固定相的支持剂+流动相剧烈搅拌使两相平衡混悬液b柱中加入流动相（固定相已饱和）加入支持剂混悬液自然沉降流动相与柱床表面平齐，敲击均匀（2）上样能溶流动相+流动相→溶液→上样样品能溶固定相+固定相→溶液+支持剂→上样能溶其它溶剂+其它溶剂→溶液+支持剂挥去溶剂上样（3）洗脱（同前）注意：流动相预先用固定相饱和（4）鉴定（同前）5、实例：P164狄戈辛（异羟基洋地黄毒苷）的分离装柱：硅胶+H2O（EtOAC饱和）→搅匀、抽滤→+EtOAC（H2O饱和）浸泡→混悬液→湿法装柱上样：毛花洋地黄次生苷总苷+EtOAC（H2O饱和）→溶解→上样洗脱：0.5%MeOH-EtOAC（H2O饱和）洗脱鉴定:各流份TLC或PC检查，相同流份合并，减压浓缩，MeOH结晶得：洋地黄毒苷（Digitoxin）、羟基洋地黄毒苷（Gitoxin）、异羟基洋地黄毒苷（Digoxin）OOOOHOCH33121416洋地黄毒苷14-OH羟基洋地黄毒苷14,16-二OH异羟基洋地黄毒苷12,14-二OH（五）凝胶柱层析六