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毒理学上半部分总结目前还存在以下几点需要补充和细化的地方：⑴代谢活化的两相⑵癌基因的分类，具体机制⑶细胞恶性转化后的特点第十六章药物致突变作用的研究及其试验方法一、Ames试验（一）原理组氨酸缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌在缺乏组氨酸的培养基上不能生长，但在加有致突变原的培养基上培养，可产生回复突变，恢复合成组氨酸的能力成为野生型，能在缺乏组氨酸的的培养基上生长成为菌落，通过计数菌落出现的数目就可以估算药物诱变性的强弱。正向突变鼠伤寒沙门菌组氨酸+鼠伤寒沙门菌组氨酸-（野生型）回复突变（突变型、营养缺陷型）S9混合液受试物（二）常用试验菌株菌株名称突变基因附加突变突变类型修复LPSR因子TA97、TA98hisD△uvrBrfaPKM101移码突变TA100hisG△uvrBrfaPKM101碱基取代TA102hisG△uvrBrfaPKM101移码突变、碱基取代注：hisD,组氨酸脱氢酶的结构基因；hisG，磷酸核糖ATP合成酶的基因，TA100和TA98可推荐用于大多数致突变物和致癌物的检测（三）计量设计西药＜＝5mg/皿，中药可超过5mg/皿，最低剂量1ug/皿或0.1ug/皿，至少五种不同剂量（药物不溶于水可用DMSO或乙醇作溶剂）（四）对照组用溶媒作阴性对照；已知致突变作阳性对照；使用间接诱变物作对照时，注意平行设加S9与不加S9的对照。（五）代谢活化：S9（经诱导剂处理过的肝脏微粒体酶）（六）试验方法：渗入法；点试法（七）结果判断1、渗入法：当药物浓度达到5mg/皿仍为阴性者，可以认为是阴性。2、点试法：凡在滤纸片周围长出一圈密集的回变菌落，该药物即为致突变物质，如只在平皿上出现少数散在的自发回变菌落，则为阴性。二、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验（对象，选材，剂量，实验设计（理解），结果判定，公式（考试不给））（一）动物1、细胞：中国仓鼠肺细胞（CHL）2、剂量：至少三种不同剂量，高剂量以50%细胞生长抑制浓度，但最高不要超过10mmol/L，中低剂量采用倍量稀释法。3、代谢活化：S9（哺乳动物肝微粒体酶）进行体外代谢活化。4、药物作用时间：非活化组分别作用24和28小时收获细胞，活化组作用6小时以上。5、标本制作时间：分别在24和48h收获细胞制作标本，活化组可省略48h时间点。6、对照：空白对照、阳性对照、溶剂对照和S9对照。17、镜检：每种浓度至少观察100个中期分裂相细胞的染色体结构。8、结果判定染色体畸变率（%）=染色体畸变总数/分析染色体的总数＊100%细胞畸变率（%）=有染色体畸变的细胞数/分析染色体的细胞总数＊100%畸变率5%为阴性（-）；畸变率＞5%为可疑（+）；畸变率＞10%为弱阳性（++）；畸变率＞20%为中度阳性；畸变率＞50%为强阳性；若某一测试点呈现可重复的并有统计学意义的增加也为阳性。（二）人体外周血淋巴细胞染色体畸变试验1、剂量：同动物2、对照：溶媒作阴性对照，已知染色体断裂剂作阳性对照。3、外周血的采集与培养，静脉2-3ml，加抗凝剂，培养加肝微粒体酶，药物处理24h或48h终止培养前加秋水仙素获得更多中期细胞4、培养细胞的处理，离心，固定5、标本制作6、染色，Giemsa染色20min7、镜检8、结果判定三、啮齿动物微核试验（实验过程，剂量选择，步骤，镜检，如何分辨细胞）（一）原理骨髓细胞经致突变作用，染色体可发生畸变以致断裂，其断裂的碎片在分裂间期留在子代细胞内形成规则的一个或几个圆形或椭圆形结构的小块物质，由于它比普通细胞核要小，称之微核。但骨髓细胞中缺乏代谢活化酶系，对间接诱变物反应较差。有核细胞胞浆少，正常核叶极难与微粒相辨认，在无核的红细胞中才易于辨认。微核检出率与染色体畸变率之间有明显相关性。（二）剂量：至少三种剂量，最高剂量以1/2LD50为基准，低剂量结合药效学及临床拟用剂量，再按一定比例插入中间剂量。（三）实验过程NIH小鼠，每组10只性成熟动物（雌雄各半）或至少6只性成熟雄性动物1、给药：一组生理盐水，一组环磷酰胺腹腔注射。2、涂片：24h后处死，解剖取胸骨，骨髓挤于有一滴小牛血清的载玻片上，推片。3、固定：甲醇固定15min4、染色：Giemsa染液5、观察计数：典型的微核呈圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，用Giemsa染色后呈紫红或蓝紫色。多染红细胞PCE呈灰蓝色，正染红细胞呈桔黄色。计数1000个PCE中含有微核的PCE数。如不易区分，记录总的微核率即可。四、果蝇伴性隐性致死试验（实验设计原理，结果鉴定）（一）原理亲代雄性果蝇接触药物后X染色体出现隐性致死突变，则F1代雌性果蝇中不表达，而F2代雄性果蝇数中因有一半接受了这个已发生突变的X染色体，结果F2代雄性果蝇比雌性果蝇数目少了一半。至少两个剂量：最高剂量为1/2LD50、低剂量为1/4LD50，无毒物最大给药量为5%（二）结果判定致死突变率%=致死管数/受试染色体数*100%1、致死突变率大于自然突变率的2倍，并有剂量反应关系时为阳性；2、F2代，有一支培养管中，雌雄合计20只以上而未发现有雄果蝇为阳性，有2只以上雄蝇为阴性。3、F2代有一支培养管中，雌雄合计少于20只或只一只雄果蝇为可疑，需观察F3代。4、仅存雌雄亲本而无子代为不育。五、啮齿类动物显性致死试验（结果鉴定，活胎死胎鉴定方式，结果统计，最后公式）结果观察：于妊娠第14天处死雌鼠，观察双角子宫内着床数、吸收胎、晚期死胎及活胎数。胚胎已完整成形，色鲜红，有自然运动，机械刺激后有运动反应的为活胎。胚胎完整成形，并有明显胎盘，但色泽灰暗，无光泽，无自然运动，机械刺激后无运动反应的为晚期死亡胚胎。早期死亡的胚胎的大小，外形和色泽可因死亡时间的相对早迟及死后自溶时间的长短变化很大，一般胎盘较小或不明显，胎盘形体较小，外形不完整，各部位发育尚不完全，呈紫红色，无自然动作。21、平均受孕数（%）=受孕母鼠总数/同笼母鼠总数*100%2、平均着床数=总着床数（早死、迟死、活胎数）/受孕母鼠总数3、平均活胎数=活胎总数/受孕母鼠总数4、平均死胎数=死胎总数/受孕母鼠总数5、含死胎孕鼠数（%）=含一个以上死胎（早死、迟死）的孕鼠数/受孕母鼠总数*100%6、突变指数（M1）=总死胎数/总着床数*1007、显性致死率（DL，%）=（1-试验组的平均生存胎仔数/阴性对照妊娠鼠的平均生存胎仔数*100%结果判断：生存胎仔总数减少，死亡胎仔总数增加；胚胎总着床数减少或未着床胚胎数增加，这些结果有统计学意义并有剂量反应关系时记为阳性。六、程序外DNA合成（UDS）试验（原理，方法）1、原理正常细胞仅在S期进行DNA复制合成，当DNA受损时可发生在S期以外的时期，称程序外DNA合成。测定S期以外3H-胸苷掺入胞核的量，掺入量可反映DNA损伤后修复合成的情况。2、方法选用人淋巴细胞或大鼠肝原代细胞，采用放射自显影方法，受试物至少三种浓度，最高仅对细胞产生轻微毒性或无毒性。在显微镜下计数银粒数，给药组与对照组有统计显著差异，并有浓度效应关系时阳性。七、SOS显色反应（原理）原理：DNA分子在受到外因作用引起大范围损伤，其复制又受到抑制的情况下，会导致一种容易发生错误的修复。通过直接检测DNA损伤后的SOS修复反应来检测化合物的生物遗传毒性。SOS反应系统的RecA蛋白即转化为RecA蛋白水解酶分解阻遏蛋白，使受阻遏的sifA基因去阻遏，启动lacZ基因翻译、转录、表达，表达产物即为半乳糖苷酶，可分解邻硝基苯β-D-半乳糖苷（ONPG），产生黄色可溶性物质，据颜色深浅对被诱导酶定量测定，从而判断DNA损伤程度。比率R=β-半乳糖苷酶单位/碱性磷酸酶单位=A420B*tp/A420P*tBA420B:波长为420nm处β-半乳糖苷酶显色底物的光密度。tp:碱性磷酸酶底物的显色时间。A420P:波长为420nm处碱性磷酸酶显色底物的光密度。t：β-半乳糖苷酶显色底物的显色时间。B第十七章生殖发育毒性（了解几个概念：FSH，LH等，下丘脑-垂体-睾丸图要记住，铅，镉的影响）LH：垂体促黄体激素，与G-蛋白偶合受体结合，刺激间质细胞产生睾酮。FSH：促卵泡激素，促进支持细胞成熟，形成血-睾屏障，产生一系列调节蛋白和生长因子。GnRH：促性腺激素释放素，由下丘脑产生。+—精子下丘脑GnRH垂体LH，FSH睾丸+—+—雄激素一、化学物质对下丘脑-垂体-性腺轴激素调节女性:镉，蓄积在小鼠垂体前叶，使FSH，LH合成减少，进而影响卵巢发育和排卵，干扰雌激素和孕激素的合成和释放，导致输卵管和子宫萎缩，影响卵子的运行和胚胎的着床。男性：铅作业的工人血清FSH，LH和睾酮的水平明显低于对照组，并与血铅含量有剂量反应关系。原因是铅可影响下丘脑GnRH释放，表现为精子数目减少，活力减弱，性欲降低和性功能障碍。二、胚胎发育各阶段及毒性（人类啮齿类发育的时间，每个阶段的时间，特点）1、着床前期：从受精到完成着床之前，对胚胎致死作用较为敏感，往往出现胚胎死亡；人类妊娠3最初11-12天，啮齿类最初6天左右。特点：很少分化（受精-卵裂-形成胚囊）受精卵在着床前迅速分裂成一个内空的球状物，即胚泡。未分化细胞收化学毒物损失致胚泡死亡称着床前丢失。（甲基亚硝脲——神经管缺陷和腭裂）2、胚胎期（器官形成期）：致畸敏感期（第三周）；人3-8周，大鼠小鼠兔为6-15天—15-18天，器官形成容易受到致畸物作用而诱发器官结构的缺陷。3、胎儿期：生长迟缓，器官形态结构异常，功能缺陷；（第9-41周）4、新生儿期：生长迟缓，神经、内分泌、以及免疫系统功能改变，儿童期肿瘤。（出生后至一个月）三、致畸作用机理（一）基因突变（二）干扰基因表达（三）干扰核酸功能和有丝分裂（记住）1、抑制DNA合成2、干扰DNA复制，转录和翻译3、干扰纺锤体形成并阻碍染色体分离的化合物（四）营养缺乏和能量不足：维生素、无机盐类（五）重要酶类被抑制四、影响药物致畸的因素（一）种属差异和个体差异1、胚胎发育的遗传特征不同2、化合物在母体或子体内代谢过程不同3、物种胎盘构造差异使化合物透过胎盘屏障的量和速度不同（二）接触药物的时间（三）药物作用剂量（四）药物的理化性质（五）母体健康一般生殖毒性实验：剂量设置（详细记），所有内容，给药时间，指标，观察报告五、生殖评价一般方法：致畸实验：全部，实验设计围产期毒性实验（一）一般生殖毒性试验研究药物对整个生殖过程的影响，包括生殖细胞的发生、卵细胞受精、着床胚胎形成、胚胎发育阶段等。检测药物对生殖腺，性周期，交配能力，受孕率和胚胎早期发育的影响。1、动物：多用性成熟大鼠，或小鼠和白兔，每组雄性动物20只，雌性动物20只以上2、剂量与给药途径：3个剂量组，高剂量可产生轻度毒性反应，低剂量不应有任何中毒症状中间剂量与高低成等比。给药原则上与临床拟用途径同。3、给药时间：交配前，雄性约60-80天，雌性约14天，连续给药；雌性交配后继续给药至器官形成期。此段时间包括了精子发生期和排卵期。4、交配：检测交配率的方法：查找精子和查找阴栓。5、对照：阴性（溶剂）对照组，也可设阳性对照组。6、观察与报告：观察动物的一般状况、体重变化、给药14天处死50%孕鼠，剖开子宫记录黄体数，着床数和吸收胎数，计算受孕率、、死胎数、活胎重量、内脏及骨骼的变化。另一半孕鼠等到分娩和哺乳结束。（交配数、黄体数、着床数、着床前死亡率、着床后死亡率活胎数、胎盘重量、子宫重量以及外观、等）。（二）致畸胎试验首选大鼠，每组孕鼠15只以上（孕兔8只以上）；致畸作用剂量效应曲线比较陡峭，最大无作用剂量与引起胚胎大量死亡以及母体中毒死亡剂量比较接近，因此实验要求找出致畸阈剂量，保证母体生育能力，不至于大量流产和胚胎死亡。需进行预试验，找出母体中毒剂量。高中低三个剂量组，高剂4量为母体轻度毒性反应；低剂量不应观察到任何中毒反应，中剂量允许出现轻微中毒反应。与临床给药途径同，在胚胎器官形成期连续给药；大鼠孕后6-15天；设溶媒对照和阳性对照；孕后第20天处死，观察记录。记录黄体数，活胎数，活胎重，死胎数，吸收胎，早期死亡胚胎，晚期死亡胚胎。胎仔的