中国马铃薯卷叶病毒CP基因序列分析0901

30个马铃薯卷叶病毒CP基因序列分析韩树鑫2白艳菊*1,2张威1,2高艳玲1,2范国权1,2张抒1申宇11.黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所，哈尔滨，1500862.东北农业大学，哈尔滨，150030摘要：通过对不同的含有PLRV的样品进行RT-PCR扩增，成功的克隆了PLRVCP基因，经比对样品的CP基因序列，核酸一致率为99.55%，仅发现了来自于广东的样品与其它样品有5个碱基的差异。试验样品与国内以报道的PLRVCP基因进行进化分析，不同地区的PLRVCP基因可分为A,B共2组，且有区域性特征，来自广东、云南及贵州的样品在两组中均有分布，但来自于内蒙古的样品仅聚类在A组。而中国样品与其他国家PLRVCP基因相比较，经进化树分组后，主要分为S1和S2两组，其中S1组中，包含了所有来自于我国的样品和绝大多数其它样品，且无规律可循。而S2组中的样品仅只来自于埃及和波兰。总体上，PLRVCP序列的差异仍然较小。这说明目前PLRV病毒的种群基因较稳定。关键词：马铃薯；卷叶病毒（Potatoleafrollvirus,PLRV）；CP基因；序列分析中图法分类号：文献标示码：A文章编号：ThirtySequencesAnalysisofCPGeneofPotatoLeafRollVirusHANShu-Xin1,BAIYan-Ju*1，2,ZHANGWei1,2,GAOYan-Ling1，2,FANGuo-Quan1，2,ZHANGShu1,SHENYu11.HeilongjiangAcademofAgriculturalSciences,Harbin150086,China;2.NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China;Abstract:WeusedRT-PCRtoamplifiedthedifferentsamplesthatcontainPLRV,andwesuccessfullyclonedPLRVCPgene,comparingthesampleofgenesequenceCP,thatthenucleicacidconcordancerateofallthesampleswas99.55%,butthesamplefromGuangdongwerefoundfivebasesdifferenttoothersamples.WehadanalysedthetestsamplesPLRVCPgeneandotherPLRVCPgeneinChinathathadbeenpublishedwithphylogenetictree,thesamplesfromdifferentareacanbedividedintotwogroups,wenamedgroupAandgroupB,andwehavefoundtheregionalcharacteristicsinthetestsamples,However,fromGuangdong,YunnanandGuizhousamplesweredistributedinalltwogroups,butthesamplesfromInnerMongoliaonlyclusteringinthegroupA.ThePLRVCPgenefromChinesesamplescomparedwithothercountriesPLRVCPgenethathadanalysedwithphylogenetictree,allthePLRVCPgenecanalsobedividedintoS1andS2twogroups,allthePLRVCPgenefromChinaandmostofothercountriesPLRVCPgenewereincludedgroupS1,buttherewasnoregulation,.InthegroupS2,therewereonlythePLRVCPgenefromEgyptandPoland.Ingeneral,thedifferencesofPLRVCPgenefromdifferentareawerestillsmall.Thus,thegeneofthePLRVpopulationisstable.Keywords:Potato;Potatoleafrollvirus;PLRV;CPgene;analysisofsequences收稿日期:2015.4.20修回日期：2015.8.20基金项目：现代农业产业技术体系专项资金资助（CARS-10-P14）作者简介：韩树鑫(1984—)，男，在读博士研究生，主要从事植物病理方向的研究。E-mail:[e-mail]*通讯作者：白艳菊.E-mail:[e-mail]马铃薯卷叶病毒（Potatoleafrollvirus，PLRV)，属于黄症病毒科(Luteoviridae)马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)，主要侵染茄科植物，其能够引起马铃薯卷叶、黄化、矮缩、僵化及块茎网状坏死等病症，导致产量和品质下降。PLRV是单分子正义ssRNA病毒，全基因组长610Kb，其中第4个读码框（ORF3）是CP的编码序列，长627bp，编码产物为23kDa的多肽[1,2]。该病毒于1916年被发现，病毒主要集中于寄主体内的维管束中，且含量低[3]。PLRV在田间以蚜虫持久性传播，持毒时间久，传播距离远[4]。通常，蚜虫在马铃薯田中的密度比临近作物高，在马铃薯生长期间蚜虫密度逐渐增大，PLRV病毒感染率也随之增加[5]。由于PLRV在中国马铃薯生产区普遍发生[6]，而病毒病防治没有特效药剂，一旦感病则无法治疗和控制，所以种薯病毒检测非常重要，通过检测剔除感染病毒的植株或切断传播途径防止扩散。中国是一个幅员辽阔、地理气候等环境复杂的国家。目前，马铃薯从南到北，从东到西，全国范围内广泛分布，PLRV在各地都有发生，且新的PLRV也会随种子资源的引进而发生同步引进的风险。围绕PLRV的CP基因进行的研究比较普遍，但都是以地区划分，缺乏衔接和与国际上整体PLRV种群间的比对分析，而且，PLRV病毒是否随环境和气候的改变而有所不同尚无系统研究和阐述。PLRV的CP基因还是PLRV检测单克隆抗体的重要来源。本研究的开展有利于了解PLRV病毒的变异、重组，可以进一步了解我国PLRV的种群构成，有助于了解病毒的发生、流行特点，并为在生产中PLRV的检测鉴定、防治及其致病机理、抗病基因工程育种的研究提供理论支持和参考。1材料与方法1.1试验材料试验使用的马铃薯材料来自于黑龙江省农科院植物脱毒苗木所，于2012-2014年采集，经ELISA检测感染PLRV的马铃薯样品30份（表1）。表1：样品来源Table1:Samplesource样品Sample登录号GenbankID来源From样品Sample登录号GenbankID来源FromRV2KR051195广东RV76KR051203广东RV3KR051196广东RV83KR051204广东RV4KR051197广东RV113KR051205广东RV5KR051198广东PLRVKR051194广东RV6KR051199广东C-51KR051190广东RV7KR051200广东C-25KR051189广东RV8KR051201广东RV52KR051202广东RV27KR051177广东2014-C-221KR051179广东2014-C-243KR051181广东2014-C-441KR051184内蒙古C-60KR051191广东2014-C-437KR051183内蒙古C-75KR051192广东2014-C-435KR051182内蒙古PLRV-12-10-12KR051193广东2014-C-451KR051186内蒙古2014-C-241KR051180广东2014-C-467KR051188内蒙古2014-C-446KR051185内蒙古9-2KR051206河南2014-C-456KR051187内蒙古2014-C-179KR051178甘肃1.2引物的设计与合成根据已有的马铃薯卷叶病毒基因的保守序列，及常用于检测TotalRNA质量的内参基因NAD5的保守序列，本试验共使用三对引物，其中PLRV-F/R用于鉴定马铃薯样品是否感染PLRV病毒，NAD5-F/R用于鉴定RNA是否符合试验要求。同时设计了引物CP-PLRV-F/R用于扩增PLRV的CP序列。引物由上海生工生物工程有限公司合成（表2）。表2：引物列表Table2:Thelistofprimers引物名称PrimerID引物序列Sequence来源FromPLRV-FCGCGCTAACAGAGTTCAGCCXianzhouNie（2001）[7]PLRV-RGCAATGGGGGTCCAACTCATNAD5-FCTCCAGTCACCAACATTGGCATAAKato,S.（1995）[8].NAD5-RGATGCTTCTTGGGGCTTCTTGTTCP-PLRV-FCGGAATTCATGAGTACGGTCGTGGTTAAAGG本文CP-PLRV-RCCCAAGCTTCTATTTGGGGTTTTGCAAAGCCA1.3总RNA的提取植株总RNA的提取按照Trizol(Invitrogen)试剂说明书步骤进行。提取试验的所有离心操作均在4℃下完成，应用分光光度法测定RNA浓度及纯度，用电泳法检测RNA完整性。1.4RT-PCR检测及PLRV的CP序列扩增1.4.1cDNA第一链的合成以感染PLRV的马铃薯叶片总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链，反应步骤为：在PCR管中加入模板RNA4uL，Randomprimer1uL，用DEPC水补齐至10uL。65℃加热5min。冰上冷却2min后像PCR管中加入5×Buffer5uL，dNTP1.25uL（10mmol/L），RNasin0.5uL(40U/uL),M-MLV1uL(200U/uL)，用DEPC水补齐至25uL。在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：37℃1h，70℃15min(酶失活)后，冰上冷却，-20℃保存备用。1.4.2RNA质量和马铃薯PLRV病毒的双重RT-PCR检测以cDNA第一链为模板，使用引物NAD5-F/R和PLRV-F/R进行双重PCR扩增，使用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。双重RT-PCR鉴定PLRV病毒及RNA质量的步骤为：在PCR管中加入制备的cDNA2uL，dNTP2uL（2.5mmol/L），rTaq0.25uL（5U/uL），10×PCRBuffer5uL，上下游引物(10mmol/L)各0.5uL，用DEPC水定容到25uL的反应体系。PCR扩增条件:94℃2min预变性后进行35个循环（94℃变性20s，55.5℃退火30s,，72℃延伸30s），72℃延伸5min，4℃存放。1.4.3CP基因的扩增PLRV的CP基因的扩增与马铃薯PLRV的RT-PCR检测除退火温度为60℃外，其余步骤相同，扩增完成后同样使用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。1.5PCR产物测序及序列分析扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，交由华大基因进行测序，使用DNAMAN软件对测序结果进行拼接后对比分析，并使用MAGA6软件，通过最大相似法（MaximumLikeihood），在1000个重复下（Bootstraptrials）进行系统进化分析。2.结果与分析2.1双重RT-PCR检测结果对经DAS-ELSIA的检测受PLRV病毒侵染的30份样品(表2)进行总RNA提取和双重RT-PCR扩增检测，结果显示（图1），可以扩增到2条不同的电泳条带，条带大小分别为336bp及140bp，片段大小与试验设计相符，表明样品中的总RNA含有PLRV病毒的RNA且RNA质量良好，进一步验证了样品感染了PLRV病毒。图1：双重RT-PCR检测的试