乳酸菌的鉴定

乳酸菌的鉴定吲哚试验1）.试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管2支，分别标记乳酸菌和空白对照。2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置37摄氏度恒温箱中培养24~48小时。3）.观察记录：在培养基中加入乙醚1~2ml,经充分振荡，使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。糖发酵试验1）.试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各2支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置试管中，置37摄氏度恒温培养箱中培养24小时，观察结果。3）.观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原由颜色，其反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，杜氏小管内没有气泡为阴性反应。1.2.3乳酸的检测选用已经分离的菌种做小型发酵实验，取发酵液的上清液约10ml于试管中，加入10%硫酸1ml,再加2%高锰酸钾1ml,此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中，微火加热试管至沸，观察滤纸变化。1.结果和分析2.1乳酸菌的分离提纯在平板上出现了圆形稍扁平的黄色菌落，周围培养基变为黄色，初步定为乳酸菌⑴，取出少量在显微镜下观察到了链球状和杆状两种形状（如图一2.2乳酸菌的鉴定该菌种的菌落为圆形稍扁平的黄色菌落，有杆状和链球状两种形状。在吲哚试验中，加入菌种的试管无任何变化，证明为阴性反应（如图二）。说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。也说明此菌种不是大肠杆菌，因为大肠杆菌的吲哚试验证明为阳性。在糖发酵试验中，在加入葡萄糖的发酵培养液中加入菌种后，培养液变为黄色，反应结果为阳性，且杜氏小管内无气泡（如图三）；加入蔗糖的发酵培养液中加入菌种后的反应结果也为阳性且杜氏小管内无气泡（如图四）。证明该菌种能分解葡萄糖和蔗糖而产酸。杜氏小管内没有气泡，说明该菌种分解糖后不产气。也证明此菌种不是大肠杆菌，因为如果是大肠杆菌除了产酸反应结果为阳性外，而且杜氏小管内会有气泡，因为大肠杆菌具有分解葡萄糖和蔗糖产酸并产气的能力。为了进一步鉴定该菌种，还做了小型发酵实验，通过滤纸条变黑，说明有乳酸存在（如图五）因为在发酵液的上清液中加入10%硫酸1ml和2%高锰酸钾1ml后，此时上清液中的乳酸转化为乙醛，加热后使乙醛挥发，因此使滤纸条变黑⑴。以上种种特征均符合乳酸菌的特征。杆状的即为乳酸菌中的短乳杆菌，链球状的即为乳酸菌中的乳链球菌。2.讨论通过对菌落特征，菌体细胞形态以及该菌的生理生化反应实验和运用该菌种做小型发酵实验，证实了该菌种为乳酸菌。杆状的即为短乳杆菌，链球状的即为乳链球菌。实验证明：用BCG牛乳琼脂培养基易于得到乳酸菌。为了高效分离筛选乳酸菌，应该注意挑取具有典型特征的黄色菌落。另外，在吲哚试验中，为了保证实验的准确性，在加入吲哚试剂后切勿摇动试管，这样乙醚层就不至于被破坏。在糖发酵试验中，应该在灭菌时适当延长煮沸时间，这样可以防止倒置杜氏小管内有残留气泡。注意了上述几点有利于实验的成功性。此外随着现代科学技术的不断发展，对菌种的鉴定也逐渐应用了分子生物学手段，但由于本实验室条件有限，不能做这个方面的实验。如有条件，可以做测定DNA的G+C含量，限制性片段长度多态性分析（RFLP）,随机扩增DNA多态性分析（RAPD）等等，这样就能更精确地鉴定该菌种。参考文献（1）.黄秀梨，夏立秋等.微生物学实验指导.北京：高等教育出版社；德国：施普林格出版社，1996，6：39~60（2）.沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验（三版）北京：高等教育出版社，1996，6：119~120（3）.东秀珠，蔡妙英等编著.常见细菌系统鉴定手册.北京：科学出版社，2001，2：289~294；399~4123结果与分析3.1高产酸菌株的筛选经过分离筛选，从浆水中分离出有透明圈、菌落为乳白色，革兰氏阳性的菌株6株，分别为L-1、L-2、L-3、L-4、L-5、L-6菌株。其产酸结果见表1。表2乳酸菌的分离与优选结果菌株原浆水L-1L-2L-3L-4L-5L-6溶CaCO3圈直径(mm)-1.41.71.31.31.20.8产酸量(%)0.470.830.920.810.790.750.56由表1结果表明，各菌株溶CaCO3圈直径大小与产酸量的多少呈正相关系。其中菌株L-2的产酸量最高，达0.92%，比浆水的0.47%高1.96倍，溶CaCO3圈也最大，达1.7mm；次之为L-1，其产酸量达0.83%，比原浆水的0.47%高1.77倍，溶CaCO3圈达1.4mm；再次为L-3，其产酸量达0.81%，比原浆水的0.47%高1.72倍，溶CaCO3圈达1.3mm；另外，L-4、L-5、L-6三株菌的产酸量和溶CaCO3圈大小均不如L-1、L-2、L-3三株菌，虽然这三株菌的产酸量均比原浆水产酸量高，但溶CaCO3圈直径大小和产酸量均不如前三株菌，因此以L-1、L-2、L-3为三株高产酸菌。3.2乳酸菌的鉴定结果3.2.1纸层析鉴定结果（见表2）表3发酵液fR值测定结果样品L-1L-2L-3标准乳酸fR值0.7480.7540.7450.750从表2中可知，L-1、L-2和L-3的fR值和标准乳酸的fR值0.750几乎吻合，因此，可以说明这三株菌的发酵液中都含有乳酸。3.2.2乳酸菌的形态学特征（见表3）表3菌株的形态学特征菌株染色结果细胞形态菌落特征L-1G+短杆状、单生或短链、无芽孢扁平、边缘光滑、表面粗糙、圆形、乳白色、表面湿润、直径为2mmL-2G+菌体呈直杆状，成对或链状排列、无芽孢呈凹透镜状突起，光滑、圆形、乳白色、半透明、直径为1～2mmL-3G+菌体呈球状或豆状，单个或短链排列、无芽孢呈凹透镜状突起、圆形或豆状、不透明、灰白色、直径0.5～1.5mm3.2.3生化特性鉴定结果（见表4）表4菌株的生理生化实验结果菌号L-1L-1L-1H2O2酶试验---明胶液化---硝酸盐还原---石蕊牛乳胨化胨化胨化柠檬酸盐+++pH=9.6生长生长生长pH=4.6生长生长生长硫化氢产生硫化氢产生硫化氢产生硫化氢产生葡萄糖+++乳糖+++果糖+++蔗糖+++注：＋为阳性反应；－为阴性反应；±为不确定性反应根据菌株的形态学特征（表3）和生理生化试验结果（表4），并参考文献[10][12]，初步鉴定菌株L-1、L-2与L-3分别为短乳杆菌（Lactobacillusbrevis）、植物乳杆菌（Lactobacillusplanetarium)和肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)。4讨论在自然界乳酸菌种类繁多，资源丰富，利用乳酸菌纯种发酵法生产浆水，可以避免一些杂菌的污染，引起腐败变质。说明了乳酸菌在浆水发酵过程中发挥着重要的作用，很可能就是引起浆水发酵的优势菌种，可以作为纯种发酵浆水。在浆水中优势乳酸菌的问题上大多国内文献也集中于明串珠菌和乳杆菌。集中于优势菌种，而所谓的“优势”也是以产酸速度好及耐酸性来衡量的，所以明串珠菌和乳杆菌在这方面就占有很大优势。本试验中分离出的优势菌与文献[11]报道的一致。根据文献[7]浆水中的优势菌除了乳酸菌外，还有少量的酵母菌，其次尚有少量放线菌，霉菌为污染菌，由于时间的原因本试验只分离了乳酸菌，以后有可能会分离其他的优势菌；而且乳酸菌只鉴定到了属，是因为本试验只做了初步的生理生化鉴定，也没有做分子学等微观鉴定而导致的。5结论经过分离筛选，从浆水中分离出三株高产酸菌株，并对各个菌株进行形态学特征观察以及石蕊牛乳试验、硝酸盐还原试验、柠檬酸盐试验、硫化氢生成实验、糖发酵试验、产酸速度等一系列生理生化试验，综合这些鉴定结果，L-1初步鉴定为短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)，L-2初步鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillusplanetarium)，L-3初步鉴定为肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)。参考文献[1]云月英.青海海西州传统酸发酵山羊奶的化学与微生物组成与微生物组成分析及乳酸菌的分离鉴定[D].内蒙古农业大学,2006:[2]闫肃,吕嘉枥,郜洪涛.乳酸菌在食品工业中的应用[J].中国酿造,2010,(12):1-3[3]方丽,郑明珠.酸菜汁中乳酸菌的分离与鉴定研究[J].农产品加工·学刊,2010,(09):52-58.[4]张宗舟.酸菜及其汤汁的营养价值评析[J].中国酿造,2000(05):18-25.[5]吴蕊,田洪涛,孙纪录,等.泡菜中乳酸菌优良菌株的分离鉴定及发酵性能的研