二元手性选择体系毛细管电泳分离检测未衍生化氨基酸对映体的研究

31二元手性选择体系毛细管电泳分离检测未衍生化氨基酸对映体的研究陈裕富谢天尧*（中山大学化学与化学工程学院，广州510275）摘要以铜-L-赖氨酸作为配体交换选择剂，与羟丙基甲基纤维素（HPMC）构成二元手性选择体系，在熔融石英毛细管（50µmi.d.×50cm）中，用毛细管区带电泳－电导法成功对未衍生化苯丙氨酸对映体（D,L-Phe）进行分离。在选定体系下：1.0mmol/LNaOH+0.4mmol/LCit+1.0mmol/LCu(Ac)2+2.0mmol/LL-Lys+20mg/LHPMC，苯丙氨酸对映体获得良好的基线分离。其线性范围为10～200mg/L，检出限（S/N=3）为3mg/L。对影响分离度的影响因素：电泳运行液组成和浓度、配体选择剂摩尔比和浓度、HPMC的浓度等进行了详细的讨论。本实验高效简便、分析成本低。关键词毛细管电泳电导检测苯丙氨酸配体交换1前言氨基酸是组成生物大分子的基本单元，在生命起源、发育、病变及衰老等生命过程中都扮演着重要的角色，是蛋白组学研究的重要内容之一[1]。苯丙氨酸(Phe)是一种重要的氨基酸，是人和动物8种必需氨基酸的其中之一，其结构如图Ⅰ所示。苯丙氨酸[2]主要用作试剂及医药上的胃肠外营养输液，亦见用作特殊人员合成膳食、必需氨基酸片等营养强化剂的成分；苯丙氨酸还可作为昆虫人工饲料的成分；苯丙氨酸对治疗苹果疱茄病亦有效。L-苯丙氨酸是人和动物所需要的一种氨基酸，而D-苯丙氨酸是生产艾滋病病毒抑制剂的重要中间体[3]。配体交换法是氨基酸手性分离的常用方法，基于配体交换原理的分离方式有气相色谱手性固定相法、液相色谱法、薄层色谱法、膜分离法、毛细管电泳法[4]等。目前已经报道的苯丙氨酸对映体的拆分方法，主要有高效液相色谱[5]、手性膜法[6]、薄层色谱[7]、离子色谱法[8]和毛细管电泳[9]等。氨基酸由于其结构简单，分离难度较大，且没有紫外或荧光吸收，通常需要柱前、在柱或柱后衍生才可得到检测。电导检测法具有通用性，氨基酸无须经过衍生即可检测，操作大大简化，是氨基酸一种理想的检测方法。本实验以铜-L-赖氨酸作为配体交换选择剂，与羟丙基甲基纤维素（HPMC）构成二元手性选择体系，用毛细管区带电泳－电导法成功对未衍生的苯丙氨酸对映体进行分离，方法高效简便、分析成本低，可发展于实际样品的分析应用。2实验部分2.1仪器与试剂CES2003毛细管电泳仪（高压电源、电导检测器、毛细管电泳数据工作站，中山大学化学与化学工程学院研制）；pHS-3C精密酸度计（上海伟业仪器厂）；石英毛细管柱50cm×50µm（河北永年光导纤维厂），*第一作者陈裕富（1983年出生），男，中山大学化学与化工学院应用化学A专业2003级指导教师谢天尧Email：cesxty@.mail.sysu.edu.cn32CQ-2B型超声波清洗器（明珠电器有限公司）。图Ⅰ苯丙氨酸的结构式(Phe,pI=5.48)Fig.ⅠThestructureofPhenylalanineandLysin(Phe,pI=5.48)氢氧化钠（NaOH，广州化学试剂厂，分析纯）、柠檬酸(Cit，天津市大茂化学试剂厂，分析纯)、乙酸铜（Cu(CH3COO)2·H2O，天津市科密欧化学试剂开发中心，分析纯），羟丙基甲基纤维素（HPMC，山东赫达股份有限公司，分析纯），D,L-苯丙氨酸、L-苯丙氨酸（D,L-Phe、L-Phe，上海科学院生物化学研究所，层析纯），L-赖氨酸（L-Lys，上海伯奥生物科技有限公司产品，层析纯）。所用水为超纯水。2.2溶液的配制分别配制0.1mol/LNaOH、0.1mol/LCit、25mmol/LCu(Ac)2、25mmol/LL-Lys和100mg/LHPMC储备液。实验时，各取适量以制得不同浓度的电泳运行液。D,L-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸配制成1mg/mL的储备液，进样时用缓冲液稀释到所需的浓度。2.3实验方法毛细管柱在使用前依次用去离子水、0.1mol/LHCl溶液、去离子水、0.1mol/LNaOH溶液、去离子水和运行缓冲液分别冲洗约5min，检测电极用超声波清洗，电极及检测池的制作参见文献[10]。采用电动进样方式，进样时间为8s，进样电压为9.0kV，分离电压为＋15kV。实验在室温（25℃）、相对湿度75%的实验条件下进行。3结果与讨论3.1手性选择体系的选择实验仅采用铜离子作手性选择剂，苯丙氨酸对映体未能达到分离，结果见图Ⅱ.a；在铜离子存在的运行液中，加入L-赖氨酸，以Cu-L-Lys作配体络合手性选择剂，苯丙氨酸对映体不能达到基线分离，见图Ⅱ.b；实验中发现，在上述体系中添加羟丙基甲基纤维素（HPMC），苯丙氨酸对映体的分离度得到改善，如图Ⅱ.c所示。因此采用Cu(II)-L-Lys-HPMC的运行体系，本文认为HPMC和Cu(II)-L-Lys形成二元手性选择剂协同体系，提高了对映体的分离度。3.2铜和L-赖氨酸络合物配比和浓度对分离度的影响在配体交换中，配体和中心离子的选择、配体与中心离子的浓度比、配体与中心离子形成的络合物的浓度对分离度有至关重要的影响。本实验通过固定Cu(II)的浓度为1.0mmol/L，改变L-赖氨酸的浓度(1.0mmol/L,1.5mmol/L,2.0mmol/L,3.0mmol/L)，考察了不同摩尔配比对分离度的影响，见表I所示。结果发现当Cu(II):L-Lys=1:1时，对映体得不到分离；当配比为1:1.5时基本可以分离对映体；当配比达到1:2时，对映体已达到基线分离；当配比为1:3时，对映体峰的迁移时间增加，分离效果没有得到改善。因此，本实验选择铜和L-赖氨酸络合物的最佳配比为1:2。固定铜和L-赖氨酸络合物的摩尔配比为1:2，在0～2.0mmol/L浓度范围内考察铜和L-赖氨酸络合物浓度对苯丙氨酸分离度的影响。逐渐增大络合物的浓度，分离度提高，对映体迁移时间减少；当络合物浓度超过1.5mmol/L时，分离度明显下降，对映体得不到分离（见表I）。因此，本实验选取络合物的最佳添加浓度为铜:L-赖氨酸＝1.0mmol/L:2.0mmol/L。3378910aSignal/mVUt/min13141516bt/min151617181920ct/min图Ⅱ三种不同的手性选择体系对分离度的影响Fig.ⅡTheeffectofthreedifferentchiralselectorsontheresolutiona.Cu(II)b.Cu(II)+L-lysc.Cu(II)+L-Lys+HPMCConditions:(concentrationofCu(II),L-Lys,HPMC:1.0mmol/L,2.0mmol/L,20mg/L);1.0mmol/LNaOH+0.4mmol/LCit;workingvoltage:15kV;injectiontime:8s;injectionvoltage:9.0kV.表I铜和L-赖氨酸络合物配比和浓度对分离度的影响Tab.ITheeffectofconcentrationratioofCu(Ⅱ)toL-Lys,concentrationofCu(Ⅱ)andL-LysontheresolutionconcentrationratioofCu(Ⅱ)toL-Lys(mmol/L:mmol/L)1:11:1.51:21:3Rs01.01.31.3concentrationofCu(Ⅱ)andL-Lys(mmol/L:mmol/L)0.75:1.51.0:2.01.5:3.02.0:4.0Rs0.61.30.40.2Conditions:1.0mmol/LNaOH+0.4mmol/LCit+20mg/LHPMC;otherconditionsasFig.Ⅱ.3.3HPMC浓度对分离度的影响羟丙基甲基纤维素（hydroxypropylmethylcellulose,HPMC）是水溶性高分子，其结构单元中含有多个手性中心，结构式如图Ⅲ所示。图Ⅲ羟丙基甲基纤维素（HPMC）结构式Fig.ⅢThestructureofhydroxypropylmethylcellulose纤维素在高效液相色谱中可用作制备手性固定相拆分手性药物，也可用于毛细管电泳手性分离中增大34对映体分离度，具有一定的手性识别作用[11]。在本实验中，单独使用HPMC并不能使苯丙氨酸对映体分离，在铜和赖氨酸络合的体系中不加HPMC时苯丙氨酸对映体的分离度很小，加入HPMC后，样品的迁移时间增加，分离度增大，本文认为HPMC和Cu-L-Lys形成二元手性选择剂协同体系，有效提高了手性分离度。考察HPMC浓度为0～40mg/L，在20mg/L时对映体已达到基线分离，继续增加HPMC的浓度，分离度改变不明显，且基线不稳（如图Ⅳ）。综合考虑分离度和分析时间，本实验选择HPMC的最佳浓度为20mg/L。0102030400.00.20.40.60.81.01.21.4RsHPMC/mg.L-1图ⅣHPMC浓度对分离度的影响Fig.ⅣTheeffectofHPMCconcentrationonseparationConditions:1.0mmol/LNaOH+0.4mmol/LCit+1.0mmol/LCu(Ac)2+2.0mmol/LL-ys;otherconditionsasFig.Ⅱ.3.4缓冲溶液的组成、浓度及pH的影响通过对比柠檬酸(Cit)－氢氧化钠(NaOH)、乙酸钠(NaAc)－氢氧化钠(NaOH)、硼酸(H3BO3)－乙酸(HAc)和乙酸铵(NH4Ac)－乙酸(HAc)这几种缓冲体系，实验发现只有在柠檬酸(Cit)－氢氧化钠(NaOH)缓冲体系中，苯丙氨酸对映体才能得到分离，其他的缓冲体系则不能分离。NaOH－Cit体系在电导检测法中有良好的基线和灵敏的响应，但缓冲溶液浓度太高会引起基线漂移。实验选择Cit浓度为0.4mmol/L。固定柠檬酸浓度后，加入氢氧化钠以调节运行液的pH。由于氨基酸具有等电点，是两性物质，缓冲溶液的pH对其对映体的分离影响很大。在0～1.7mmol/L浓度范围内考察氢氧化钠浓度对分离度的影响，实验发现在5.8～6.1范围内，pH为分离的最佳范围，对映体的分离度最好，见表Ⅱ所示。表ⅡNaOH浓度对分离度的影响Tab.ⅡTheeffectofNaOHconcentrationontheresolutionTheconc.ofNaOH（mmol/L）00.20.40.81.01.2pH4.85.05.25.86.06.3Resolution(Rs)0.80.91.01.11.30.9Conditions:0.4mmol/LCit+1.0mmol/LCu(Ac)2+2.0mmol/LL-Lys+20mg/LHPMC;otherconditionsasFig.Ⅱ.3.5进样方式的选择本实验对比了气压进样、重力进样和电动进样三种方式对样品测定结果的影响。电动进样具有较好的精密性，且操作简单，电动进样得到电堆积效果，进而提高检测灵敏度，但是进样量较大时会引起区带展35宽，使分离度下降，线性范围较窄；采用压力进样的峰形较窄，重现性不好，灵敏度较低，分离度没有改善；采用重力进样的分离度下降，且会出现杂质峰。综合上述因素，本实验采用电动进样方式，进样电压为9.0kV，进样时间为8s。3.6分离电压的选择本实验考察了分离电压从9kV至21kV对分离的影响，电压较低时，样品分离度增大，但是分离时间太长；加大分离电压，可以缩短分离时间，但同时分离电流也增加，产生的焦耳热也增大，体系运行不稳，甚至有气泡产生，严重影响实验效果，柱效和分离度下降。综合上述因素，本实验选择分离电压为15kV。3.7线性范围、检出限和精密度在上述选定的实验条件下：1.0mmol/LNaOH+0.4mmol/LCit+1.0mmol/LCu(Ac)2+2.0mmol/LL-Lys+20mg/LHPMC（pH=6.0），苯丙氨酸对映体的毛细管电泳分离谱图如图Ⅴ所示，D型苯丙氨酸比L型先出峰。峰