中药天然药物免疫毒性(过敏性光过敏反应)

中药、天然药物免疫毒性（过敏性、光过敏反应）研究的技术指导原则中药、天然药物免疫毒性（过敏性、光过敏反应）研究的技术指导原则一、概述免疫毒理学是毒理学中一门重要的分支学科，其目的是探讨外源性化合物对机体（人和实验动物）免疫系统产生的不良影响及机理。免疫毒性是指外源性化合物对机体免疫系统的损伤作用，包括两类，一是免疫抑制，即免疫系统的广泛抑制，可致机体对感染的易感性增加及肿瘤发生率增高；另一是免疫增强，即免疫系统反应性过度增强，可能包括免疫性产生，过敏反应（超敏反应或变态反应）、自身免疫反应以及不良免疫刺激等。过敏反应指变态反应，又称超敏反应，是指机体受同一抗原再次刺激后产生的一种异常或病理性免疫反应。按抗原与抗体或细胞反应的方式和补体是否参加等，将过敏反应分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四型。其中Ⅰ型过敏反应是了解得最多的一种过敏反应，目前采用的过敏试验方法多数是根据Ⅰ型过敏反应发病机制的不同环节而设计建立的。光过敏反应为IV型过敏反应的特殊类型，是局部给药和全身给药后，分布在皮肤的药物中所含的感光物质与光线产生复合作用使得用药后皮肤对光线产生的不良反应。中药、天然药物为一种外源性物质，也可能作为过敏原引发机体产生过敏反应。由于免疫系统是增生活跃的系统，因此对外源性物质非常敏感，但每一种化学物质都有其特定的靶器官，因此不必盲目地对所有受试物进行免疫毒性监测，而是选择性地对某些受试物特别是以免疫系统为靶器官的毒物进行研究。用于某些适应症的药物，因其作用机制的特殊性，对人体免疫系统可能产生影响；另外，当受试物是已知的免疫调节剂的情况，或在安全性评价过程中初步发现对免疫系统有明显影响的药物也应进行免疫毒性的评价。若需要进行其他免疫毒性评价的药物，建议可在其长期毒性试验中，增加免疫系统损伤的评价指标。因人群免疫毒理学研究存在下述困难：在人群中观察到免疫功能损伤需要的时间较长，且人群接触的剂量较低，也难以观察到剂量-反应关系。人群免疫毒理学研究中缺乏特异性指标，缺乏非损伤性方法。对免疫功能检测结果评定时缺乏正常值或参考值。因此，认为动物免疫毒理学评价对估测人群的免疫毒性具有一定的意义。该技术指导原则适用于拟用于人和/或已上市的中药、天然药物的免疫毒性研究。主要内容包括免疫毒性评价中的过敏反应试验和光过敏试验。二、基本内容（一）基本原则根据《中华人民共和国药品管理法》，药物的免疫毒性试验必须执行“药物非临床研究质量管理规范”。实验设计应符合随机、对照、重复的原则。应在遵循安全性评价普遍规律的基础上，运用具体问题具体分析的方法，结合受试物的自身特点，充分考虑和结合药学、药效学、其他毒理学（长毒、急毒）及拟临床应用情况等信息，体现整体性、综合性的原则，在阐明其研究方法或手段科学、合理的前提下进行规范性试验，对试验结果应进行全面分析和综合评价，以达到免疫毒性研究的目的。（二）过敏反应试验1．试验中应考虑的问题1.1方法中药、天然药物应进行何种过敏反应研究，可根据药物自身特点、临床适应症和给药方式确定。通常局部给药发挥全身作用的药物（如注射剂和透皮吸收剂等）需考察Ⅰ型过敏反应，如注射剂需进行主动全身过敏试验和被动皮肤过敏试验，透皮吸收剂需进行主动皮肤过敏试验等。Ⅱ和Ⅲ型过敏反应可在进行长期毒性试验中选择相关指标进行观察，如观察动物的体征、一般表现及免疫系统损伤的评价指标等。经皮给药制剂（包括经皮给药发挥全身作用或局部作用的药物）应进行IV型过敏反应试验。具体试验方法的选择应根据给药途径、过敏反应发生机制、影响因素和临床意义等为基础进行选择，如主动皮肤过敏试验、主动全身过敏试验、被动皮肤过敏试验、Buehler分析法（BT）、豚鼠最大值法（Guinea-PigMaximizationTest,GPMT）等，也可采用其它的检测方法，但需阐明其合理性并说明具体方法及操作流程。1.2受试物过敏试验中的受试物应同临床应用制剂相一致，即采用中试或中试以上规模的、制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的样品。否则，应有充分的理由。同时，注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等。试验中所用辅料、溶剂或赋形剂等应标明批号、规格和生产厂家，并符合试验要求。1.3对照过敏试验均应设立阳性对照和阴性对照。1.4剂量可选择多个剂量进行试验，尽可能找出无过敏反应的剂量，以提示临床进行脱敏处理的起始剂量；也可避免因剂量过低而出现假阴性结果；另外，可帮助判断阳性结果是否因强刺激反应而引起。1.5给药途径（1）皮肤给药：经皮给药的受试物应保证在局部的有效暴露时间。（2）静脉给药：应注意给药剂量和给药速度对动物过敏反应发生的影响，排除类过敏反应。静脉注射进行激发试验中应保证足量、一次性快速地将受试物注射入动物体内。2、Ⅰ型过敏反应试验Ⅰ型过敏反应又称速发型过敏反应或超敏反应，药物分子本身为过敏原，进入机体刺激免疫系统产生相应的IgE抗体，IgE抗体附着在肥大细胞及嗜碱性细胞上使之致敏，当同一抗原再次进入机体后，即与肥大细胞及嗜碱性细胞表面的IgE抗体发生抗原抗体反应，导致肥大细胞及嗜碱性细胞脱颗粒并释放生物活性介质，作用于不同的组织和器官，产生不同的病理生理反应。临床表现为过敏性休克、支气管哮喘、变应原鼻炎、胃肠道与皮肤过敏反应等。Ⅰ型过敏反应通常用主动皮肤过敏试验（ACA）、主动全身过敏试验（ASA）和被动皮肤过敏试验（PCA）等考察，对于吸入途径药物常采用呼吸道敏感性检测。2.1主动皮肤过敏试验（ActiveCutaneousAnaphylaxis,ACA）皮肤过敏是一种受试物产生免疫学传递的皮肤反应。当动物初始接触受试物后至少1周，再进行受试物的激发接触，有可能导致过敏状态。本试验的目的是观察受试物经皮肤重复接触受试物后，机体免疫系统反应在皮肤上的表现，即有无过敏反应及过敏强度如何。2.2主动全身过敏试验（ActiveSystemicAnaphylaxis,ASA）当药物作为抗原或半抗原初次进入体内，刺激机体产生相应的抗体（IgE）。当同样药物再次进入机体，抗原与抗体结合形成的抗原抗体复合物，刺激肥大细胞及嗜碱性细胞释放活性介质，从而引起局部水肿、抓鼻、竖毛、呼吸困难、窒息、痉挛，甚至休克死亡。本试验的目的是观察受试物给药后对动物引起的过敏反应。2.3被动皮肤过敏试验（PassiveCutaneousAnaphylaxis,PCA）被动皮肤过敏试验是一种较敏感的测试特异抗体滴度的方法。将受试物致敏动物的血清（含丰富的IgE抗体）给正常动物皮内注射，IgE的Fc端与皮肤的肥大细胞表面的特异受体结合，形成IgE的复合物，使肥大细胞致敏。当抗原攻击时，抗原与肥大细胞表面上IgE的Fab端结合，导致IgE分子结构的改变，引起肥大细胞脱颗粒，释放过敏介质如组胺、慢反应物质等，使皮肤局部血管的通透性增加，使静脉注射抗原的同时注入的伊文思蓝染料在该皮肤处渗出着色。根据局部皮肤蓝染范围或程度，可判定血管通透性变化的大小，继而判定皮肤过敏反应的程度。上述三种试验方法可参见附录。3、Ⅱ型和Ⅲ型过敏反应试验Ⅱ型过敏反应又称细胞毒或溶细胞型。药物分子进入机体后附着在细胞膜（通常是血细胞）上，并刺激免疫系统产生相应抗体，参与的抗体主要是IgG和IgM，特点是由抗体直接与靶细胞膜上的抗原结合而导致细胞溶解。临床可表现为药物性溶血性贫血、粒细胞减少和血小板减少性紫癜等。Ⅲ型过敏反应又称免疫复合物型或血管炎型。药物分子进入机体刺激免疫系统产生相应抗体（IgG,IgM），当抗原抗体两者呈一定比例时形成免疫复合物，沉积于组织的血管基底膜上，导致血管壁的损伤及炎症反应。常见反应如血清病、变应性肾小球肾炎、全身性红斑狼疮样反应等。上述两种过敏反应尚无标准的临床前试验进行预测。当药理学和毒理学试验结果提示有潜在的II和III型过敏反应时，建议可进行进一步的相关试验研究。4、IV型过敏反应试验Ⅳ型过敏反应又称迟发型。药物直接作用于T淋巴细胞使之致敏，当同一药物再次接触已致敏的淋巴细胞，则激发致敏淋巴细胞释放介质而导致组织损伤。此类反应无抗体参与，发生较慢，一般在再次接触相同抗原48~72小时后才出现临床表现。主要表现为药疹、接触性皮炎、剥脱性皮炎等。试验方法可参见附录。（三）光过敏反应（光变态反应）试验光敏反应是用药后皮肤受光线刺激而产生的不良反应，包括光毒反应和光变态反应或光过敏反应两类，均由受试物所含的感光物质引起，但两者机制不同，实验方法、临床表现及意义亦不同。光过敏反应（光变态反应）是获得性的免疫性介导的由光激活的皮肤对光的反应，系光感物质经皮吸收或通过循环到达皮肤后与吸收的光线在表皮细胞层发生的反应。即药物吸收光能后成激活状态，并以半抗原形式与皮肤中的蛋白结合成为药物-蛋白质结合物（全抗原），经表皮的郎罕氏细胞（Langerhans）传递给免疫活性细胞，引起过敏反应的作用。光过敏反应属IV型（迟发型）过敏反应。其发生时间相对较长，且有一定的潜伏期。通常5~10天的连续用药和光照射可诱导免疫系统产生光过敏反应。再次给药时，药物和日照作用24-48小时之内即会有光过敏反应发生。光过敏反应可由局部给药和系统给药诱发，并不仅限于局部给药。因此，原则上所有给药途径的药物，只要有皮肤分布，则均应进行光敏检测。若受试物的化学结构或某些组成（包括药物和赋形剂）文献报道有光过敏作用者，或其化学结构与已知光敏剂相似者，曾有报道具有光过敏作用或可疑具有光过敏作用的中药制剂，建议作光过敏试验。本试验的目的是观察受试物接触皮肤或应用后遇光照射是否有光过敏反应。试验方法可参见附录。（四）结果分析及评价1、应详细论述实验方法，说明分组、给药剂量、动物数、用药次数等；应详细描述过敏反应的表现、反应持续时间、恢复情况及时间、死亡动物数，以利于对结果的分析和判断。在主动全身过敏反应试验中出现动物死亡时，应进行解剖，若有明显病变则应进行组织病理学检查，并提供相应的照片。2、应根据试验结果，按评分方式对不同剂量（或浓度）下反应发生情况及严重程度进行表述，分析过敏反应的量效关系和时效关系及其可逆性，判断数据变化是否与受试物有关，确定过敏反应剂量、安全剂量及安全范围等。3、结合药效学及其他毒理学试验结果进行综合分析，整体评价，注意不能将动物结果不加分析外推到人，也不能忽略甚至故意舍掉个别出现毒性反应的动物，应实事求是地反映受试物的毒性，根据试验结果得到受试物在临床应用的意义及注意事项等提示。4、引起机体免疫系统的免疫应答过程是一个十分复杂并需要不断认知的过程。因此，观察中药对机体可能存在的免疫毒性作用的研究工作应尽可能全面、深入。试验者不能以个别或少数实验结果来整体评价受试药物的免疫毒性作用，应根据免疫应答的类型、特点，结合不同实验动物的生理特性，选择合适的动物进行相关试验，以获取较为全面、客观的试验数据。应结合其他毒理学研究结果进行综合评判，方可对中药新药是否具有免疫毒性做出合理正确的结论。5、在任何临床前毒理研究期间（如急性毒性试验、长期毒性试验、致畸试验、致癌试验等）发现的免疫毒性作用，都应予以评估。（五）常见问题及处理1、中药注射剂临床应用中发生不良反应的类型较多，如诱发变态反应的类型包括：Ⅰ型过敏反应（如过敏性休克、支气管哮喘、过敏性鼻炎、胃肠道与皮肤过敏反应）、Ⅱ型过敏反应，（如溶血性贫血、粒细胞减少和血小板减少性紫癜）、Ⅲ型过敏反应（如血清病、链球菌感染后肾小球肾炎、系统性红斑狼疮）及Ⅳ型过敏反应（如接触性皮炎、湿疹型反应、移植排斥反应）。因此应根据需要，除进行Ⅰ型过敏反应试验外，应结合长期毒性试验结果分析，必要时进行Ⅱ-Ⅳ型过敏反应试验，或进一步的深入研究。2、在免疫毒性评价中，应重视给药剂量和给药速度对动物过敏反应发生的影响等。应区分伪变态反应,也称为类变态反应的概念，其表现有速发反应的特点，但其发生与免疫机制无关，是没有抗原抗体参与的非免疫机制所致。中药注射剂用药浓度过高和给药速度过快时易发生此种情况。应引起足够的重视。3、不同类型的中药制剂均可引起不良反应。注射给药，包括静脉内注射与肌肉内注射皆易引发