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专题二课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数【基础知识】一、理论基础1．筛选菌株(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时或其他微生物生长。(2)选择培养基：在微生物学中，将允许种类的微生物生长，同时和其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。（3）配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养；的微生物.加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。2．统计菌落数目（1）测定微生物数量的常用方法有和。（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在的平板进行计数。此外，测定微生物数量的常用方法还有直接计数。3．设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中对实验结果的影响，提高实验结果的。例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需以培养的培养基作为空白对照。二、实验设计关于土壤中某样品细菌的分离与计数实验操作步骤如下：1．取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。应先3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的中。2．制备：准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基，将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。3．微生物的与观察将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中(体积为250mL)，充分摇匀，吸取上清液，转移至盛有的生理盐水的无菌大试管中，将土样以1、101、102……依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取进行平板涂布操作。每个稀释度下需要3个选择培养基、1个牛肉膏蛋白胨培养基。将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养，及时观察和记录。挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含培养基的斜面中，观察能否产生如教材中图2-lO的颜色反应。4．细菌的计数当菌落数目稳定时，选取菌落数在的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。三：思考与讨论（1）如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？（2）为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？(3)P183在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？（4）P183这种培养基对微生物是否具有选择作用？如果有，又是如何进行选择的？（5）P183你认为哪位同学的结果接近真实值？你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？（6）P183你能通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？专题2课题3分解纤维素的微生物的分离基础知识一、纤维素与纤维素酶1．纤维素的化学组成：三种元素，是一种糖。2．纤维素的分布：是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。3．纤维素酶的作用：纤维素酶是一种，一般认为它至少包括三种组分，即酶、酶酶，前两种酶使纤维素分解成，第三种酶将纤维二糖分解成。二、纤维素分解菌的筛选1．筛选方法：染色法。2．筛选原理：刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以为中心的透明圈，我们可以通过来筛选纤维素分解菌。三、试验设计土壤中纤维素分解菌的分离的实验方案：分解纤维素的微生物的分离的试验流程、、、、1．土壤取样：采集土样时，应选择富含的环境。2．选择培养：阅读资料二“选择培养基”，回答以下三个问题：〖思考1〗纤维素分解菌选择培养基属于培养基，原因是什么？。〖思考2〗培养基选择作用机制是什么？〖思考3〗若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是什么？(1)目的：增加纤维素分解菌的，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。(2)制备选择培养基：参照课本旁栏中的比例配制。(3)选择培养：称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在上，在一定温度下振荡培养1～2d，直至培养液变。也可重复选择培养。（4）梯度稀释：依次将培养液稀释101～107倍。思考是如何操作的？(5)将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上1制备培养基：参照课本旁栏中的比例。2倒平板操作。3涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0．1mL涂布在平板培养基上，30℃倒置培养。(6)刚果红染色法：挑选产生的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。〖思考4〗本实验流程与尿素分解菌的分离实验流程有哪些异同？3.刚果红染色法：常用的刚果红染色法有两种即两种方法的优点与不足：〖思考5〗为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？四：结果分析与评价1为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行实验，纤维素酶的发酵方法有发酵和发酵。2纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的含量进行定量测定。典型例题分析【例1】分析下面培养基的配方：KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H20、葡萄糖、尿素、琼脂。请回答：(1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别和。(2)想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用?如果具有，又是如何进行选择的?【例2】用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中得到以下几种统计结果，正确的是…()A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和2墨6，取平均值163D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2l0、240和250，取平均值233【例3】用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是()A．未接种的选择培养基B．未接种的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基C．接种了的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基D．接种了的选择培养基【例4】纤维素酶可以将下列哪种物质分解…………()A．牛肉片B．鱼片C．滤纸条D．塑料条【例5】在加入刚果红的培养基中出现透明圈的菌落是……………………()A．分解尿素的细菌B．硝化细菌C．分解纤维素的细菌D．乳酸菌【例6】本实验关于选择培养目的叙述正确的是…()A．可以增加纤维素分解菌的浓度B．可以减少纤维素分解菌的浓度C．所用培养基是固体培养基D．所用培养基是平板培养基基础自测1．PCR技术要求使用耐高温的DNA聚合酶，这种酶要能忍受93℃左右的高温。如果请你来寻找这种耐高温的酶，你会去哪里寻找………()A．土壤中B．海水中C．热泉中D．冷库中2．下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是………………()A．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、葡萄糖、尿素、琼脂、水B．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、葡萄糖、琼脂、水C．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、尿素、琼脂、水D．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水；3.某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234，那么每克样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)…()A．2.34×108B．2.34×109C．234D．23.44.在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应106培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的结果产生原因()①由于土样不同②由于培养基污染③由于操作失误④没有设置对照A．①②③B．②③④C．①③④D．①②④5.关于土壤取样的叙述错误的是………()A．土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤B．先铲去表层土3cm左右，再取样C．取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌D．应在火焰旁称取土壤6．下列材料中纤维素含量最高的是()A．杨树B．小麦C．玉米D．棉花7．纤维素酶能够分解（）A．纤维素的微生物B．淀粉的微生物C．纤维素D．淀粉8．刚果红能与哪项物质形成红色复合物()A．纤维二糖B．纤维素C．葡萄糖D．麦芽糖专题二课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、1（1）目的菌珠抑制阻止（2）特定抑制阻止(3)自养能固氮的微生物；2(1)有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。(2).稀释度细菌30-300显微镜3.非测试因素可信度无杂菌污染二、1.土壤，铲去表层土。2.培养基多于对照3.培养1ml9ml0.1mL4.30-300平均数三：思考与讨论（1）统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算（2）这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。*（3）提供碳源的是葡萄糖，提供氮源的的是尿素（4）具有只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长。（5）第二位同学的结果接近真实值改进的操作是第一位同学需设置重复实验组；第二位同学统计的三个菌落数相差太大，说明操作有误，需重新实验。（6）方案1：其他同学用A同学的土样进行实验。方案2：A同学以不接种的培养基作为空白对照。专题2课题3分解纤维素的微生物的分离[参考答案]：一、1.CHO多糖2.棉花3.复合酶C1Cx葡萄糖苷纤维二糖葡萄糖二1.刚果红2.红色复合物，纤维素分解菌，是否产生透明圈三、（流程参考课本P138）1.纤维素2〖思考1〗液体，没有添加琼脂成分.〖思考2〗以纤维素粉为唯一碳源，只有纤维素分解菌才能生存。〖思考3〗将纤维素粉改为葡萄糖。(1)纯度(3).摇床混浊(4)参照专题1的稀释操作，(6).透明圈〖思考4〗尿素分解菌的分离实验流程是将土样制成的菌悬液直接涂布在选择培养基上；本课题通过选择培养使细菌增殖后，再涂布在鉴别培养基上。其它操作基本基本共同。3.一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于在纤维素粉和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红而形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。〖思考5〗在选择培养条件下，可使能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。四1发酵产纤维素酶，液体发酵和固体发酵2葡萄糖四：典例分析1答案：(1)葡萄糖尿素(2)有选择作用。因为此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长。2答案：D3答案：C4C5C6A基础自测一、1．C2．A3．B4．A5．C6D7C8B