(生物技术)

第一章绪论1生物技术：以生命科学为基础，利用生物体系和工程原理，生产生物制品和创造具有特定性状的新品系或新品种的科学技术。2园艺植物生物技术：以园艺植物为材料，利用生物技术，创造或改良种质或生产生物制品的一门技术，它是园艺学与生物技术的交叉技术学科，是在植物组织培养、植物细胞工程、植物染色体工程、植物基因工程、生物信息学等现代生物技术手段基础上产生和发展起来的。第二章植物组织培养1组织培养：在无菌和人工控制的环境条件下，利用人工培养基，对植物的胚胎、器官、组织、细胞、原生质体等（外植体）进行离体培养，使其再生发育为完整植株的技术。2细胞全能性：植物体的每一个细胞都带有一套完整的基因组，并具有发育成完整植株的潜在能力。3脱分化：植物离体的器官、组织、细胞在培养条件下，经过多次细胞分裂而失去原来的分化状态，形成无组织结构的愈伤组织或细胞团的过程。4再分化：由脱分化状态再度分化成另一种或几种类型的细胞、组织、器官甚至最后再生成完整植株的过程。5胚状体：离体培养条件下，由植物的体细胞分化形成的类似于合子胚的结构。6园艺植物组织培养的意义：1）在育种方面单倍体育种（花药培养以及小孢子培养是获得单倍体以及纯和二倍体材料的最佳途径）；培育远缘杂种和体细胞杂交；筛选突变体；转基因育种；种植资源的保存。2）在工厂化育苗上利用脱除病毒或无病毒材料在离体条件下快速繁殖，可以解决短期内提供大批量、规格一致的种苗，提高了繁殖效率，也优化了运输的方式。3）在有用次生产物中的应用药物（人参皂苷、三七皂苷元）；蛋白质（饲料、食品工业）。4）在植物遗传、生理生化和植物病理研究中的应用。7再分化（植株再生）的三条途径：器官发生（通过茎尖培养产生大量腋芽，通过愈伤组织培养先诱导产生不定芽，通过愈伤组织培养先诱导产生不定根，不经过愈伤组织直接产生器官原基。）、胚胎发生、原球茎发生。8培养基的组成成分及其配制：培养基的成分：1）无机营养16种植物必需元素C、H、O、N、P、S、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn、B、Mo、Cl；2)有机营养糖类、维生素类、肌醇、氨基酸、有机附加物；3）植物生长调节剂IAA和CTK类；4）琼脂一般在6-10g/L；5）水；6）活性炭。培养基的配制：1）配制培养基母液：大量元素、微量元素、铁盐、有机化合物、植物生长调节剂；2）称量蔗糖，加水至总体积的3/4，溶解之；3）根据计算所需量依次加入大量元素、微量元素、铁盐、有机物、生长调节物质母液及其他特殊的附加物，混匀后定容；4）调PH值为5.8至6.0；5）分装、封口；6）灭菌。9外植体的灭菌技术：流水冲洗10-20分钟或更长时间→70-75%酒精中浸泡30秒→0.1-0.2%氯化汞溶液中浸泡10分钟左右或在10%的次氯酸钠饱和漂白粉溶液中浸泡30分钟左右→蒸馏水冲洗4-5次→备用10组织培养的步骤：外植体的选择，外植体的消毒，外植体的原代培养，试管苗的增殖与继代培养，试管苗的生根，试管苗的炼苗，试管苗的移栽与田间管理。第三章细胞工程（原生质体培养与体细胞杂交技术）1原生质体：除去细胞壁的细胞或一个被质膜包围的裸露细胞。2亚原生质体：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体叫亚原生质体。3核质体：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。4胞质体：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。5原生质体分离常用的酶及其作用：纤维素酶类果胶酶类半纤维素酶6原生质体纯化的方法：沉降法、漂浮法、界面离心法。7原生质体培养的方法：1）液体浅层培养，将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行暗培养。（优）操作简单，细胞的植板率高；（缺）原生质体容易发生粘连，难于选出单细胞无性系，难于定点观察。2）固体平板培养，混合后含有原生质体的培养基铺于培养皿底部，封口后进行培养（优）可定点观察，易于统计原生质体分裂频率；（缺）操作要求严格，植板率低。3）固液双层培养，在培养皿底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。（优）原生质体分布均匀有利于分裂，易获得单细胞株系，细胞植板率高；（缺）原生质体易破碎。4）琼脂糖珠培养，把含有原生质体的琼脂糖培养基切成块放到大体积的液体培养基中，并在旋转摇床上震荡培养以利于通气。改善了培养物的通气和营养环境，促进了原生质体的分裂和细胞团的形成，提高了原生质体的植板率。8影响原生质体培养以及植株再生的因素：基因型、原生质体的来源、起始培养密度与培养基、培养条件与培养方法、渗透压调节剂9原生质体研究的意义：1）原生质体可作为细胞无性系变异和突变体筛选的重要材料；2）原生质体是植物遗传工程的理想受体，通过裸露的质膜摄入外源DNA，有目的的引入有用基因；3）原生质体的理论和技术是细胞融合工作的基础；4）利用原生质体进行基础研究和应用研究。10体细胞杂交：将两个不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下诱导融合并培养形成杂种植株的过程。11对称融合：种内或种间两个完整原生质体的融合，可产生核与核、胞质与胞质间重组的对称杂种，并可发育为遗传稳定的的异源双倍体的杂种植株。12非对称融合：利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合，得到的融合后代仅有一方亲本的细胞核，形成不对称杂种。13体细胞杂交的过程原生质体的制备→原生质体的融合→杂种细胞的筛选→杂种细胞的培养→杂种细胞植株的再生→杂种植株的鉴定14原生质体融合的方法1)PEG诱导融合法：（优）成本低，无需特殊设备；异核率高；融合过程不受物种限制。（缺）融合过程繁琐；PEG可能对细胞有毒害。2）电融合：利用不对称的电极结构，产生不对称的电场，使粘连的原生质体膜瞬间破裂，然后与相邻的原生质体连接、闭合、产生融合。（优）不存在对细胞的毒害问题；融合效率高，一次可融合大量原生质体；融合技术操作简便。（缺）电融合仪价格昂贵。15杂种细胞的选择方法：1）显微筛选法，两种原生质体分别用不同的荧光染料标记。2)互补选择法，利用双亲融合的原生质体在生理或遗传方面产生的互补作用来进行选择，在选择培养基上双亲与体细胞杂种的生长发育不同，只有具有互补作用的体细胞杂种才能正常生长发育，而未发生互补作用的双亲不能正常生长。3）遗传标记筛选法，利用隐性非等位基因互补筛选体细胞杂种的方法，由于每一个亲本细胞贡献一个正常的等位基因，掩盖了另一个亲本的缺陷，从而使杂种细胞表现正常。16体细胞杂种的鉴定1）生物学性状鉴定：根据双亲的形态学性状进行鉴定2）细胞学鉴定：观察染色体的核型、染色体的形态差异、进行染色体计数3）生化指标鉴定：同工酶分析4）分子鉴定：RAPD、AFLP、RFLP17体细胞杂交技术的应用：1)克服生殖障碍，创造新种质；2）转移有益性状，改良作物品质；3）转移部分染色体，创造非对称杂种；4）转移胞质基因组，创造胞质杂种；5）作为育种的中间材料，进一步用于作物改良。第四章园艺植物染色体工程1植物染色体工程：按照一定的设计有计划消减、添加和代换同种或异种染色体，引发产生各种整倍性或非整倍性变异，从而改良植物的遗传基础、培育符合人们需要的新种质或新品种的方法和技术。2染色体基组：一个属内各个种所特有的、维持其生活机能的最低限度数目的一组染色体。3染色体基数：各个染色体基组所含有的染色体数目称染色体基数（X）。4单倍体：具有性细胞染色体数目的个体。5多倍体：体细胞染色体组大于2X以上的个体。6多倍体育种的意义：1）促进栽培植物的进化（如栽培小麦）；2）由于染色体加倍后的剂量效应，具有器官的巨大性、、某些营养成分含量高、抗性强等特点，无性繁殖能固定多倍体的优良性状，可直接用于生产；3）利用多倍体可育性低的特性，培育无籽品种；4）通过远缘亲本或种间不育杂种的染色体加倍，克服远缘杂交的困难，实现种属间的基因交流，合成新类型或新物种。7果树多倍体育种的途径：物理因素诱导多倍体、化学因素诱导多倍体、体细胞无性系变异、有性杂交培育多倍体、胚乳培养、细胞融合8秋水仙素诱导多倍体的原理：细胞有丝分裂时，秋水仙素可抑制微管的聚合过程，不能形成纺锤丝，使染色体不能排列在赤道板上，也不能分向两极，从而产生染色体数加倍的核。9果树多倍体的鉴定：1）直接鉴定法：染色体计数、流式细胞仪法。2）间接鉴定法：a生物学鉴定“巨大性”（苹果多倍体树体一般生长健壮，枝条较粗，节间缩短，根系粗壮，角度开张，果实硕大，叶大而厚，有时叶形也发生变化）；b细胞学鉴定气孔法、四分体法、花粉粒法（一般认为多倍体的花粉粒大，萌发孔多，花粉粒的形状变化明显）；c稍端组织学认为稍端组织层多倍体细胞比二倍体细胞明显增大。10单倍体育种：利用人工诱导单倍体植株变成纯和二倍体，或者直接将单倍体植株进行辐射或化学处理，再与目前采用的各种常规育种方法结合起来创造新品种的育种方法。11单倍体育种的意义：缩短育种年限；提高选种效率；加速诱变育种进程；克服远缘杂种的不育性。12单倍体产生的途径花药（花粉）离体培养、未授粉的子房（胚珠）培养、远缘杂交、染色体消失、异质体、孪生苗、半配合生殖、辐射诱导、化学药物诱导。13花药培养：通过无菌操作技术，把发育到一定阶段的花药，接种在人工培养基上，进行诱导、分化，最终形成完整植株的技术。14花粉培养：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养，也叫小孢子培养。15花粉花药培养的基本程序：外植体→花蕾预处理→外植体消毒→剥取花药→接种→诱导培养→分化培养16花粉花药的预处理措施主要是低温处理。其作用机理是：A低温可以改变花粉粒第一次有丝分裂纺锤体的轴向，形成两个均等的细胞，使得花粉朝着胚胎方向发育；B低温使花粉保持较长时间的活力，使营养细胞得以完成细胞质的改组而转向胚胎发生。17获得花粉的方法：机械挤压梯度离心法、自然散粉法。18园艺植物非整套染色体操作1）染色体显微操作技术染色体的分离（微细玻璃针和激光法），染色体微切割（微细玻璃针切割法和显微激光切割法）2）染色体转移技术将同特定基因表达有关的染色体或染色体片段转入受体细胞，使该基因得以表达，并能在细胞分裂中一代又一代地传递下去，该技术称为染色体介导的基因转移技术。包括微细胞介导的基因转移法和染色体介导的基因转移法。3）人工染色体：将自主复制的DNA序列、着丝粒DNA序列和端粒DNA序列三个关键序列用分子生物学的方法拼接起来得到的人造微小染色体。第五章基因分离与克隆1基因克隆：是一系列技术的总称，其核心技术是在体外将来自不同生物的基因与有自主复制能力的载体DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。2PCR（聚合酶链式反应）的基本原理：首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应物冷却至一定的温度，这一温度可以使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸，这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。影响PCR反应的因素：PCR引物、TaqDNA聚合酶浓度、dNTP、模板、镁离子浓度、PCR反应条件。3PCR引物设计时需注意的问题：1）引物长度15-30bp，常用为20bp左右；2）引物不应有发夹结构；3）引物碱基：G+C含量以40-60%为宜；4）避免引物内部出现二级结构；5）引物与靶序列的Tm值不能过低；6）引物中有或者能加上合适的酶切位点。4基因工程常用的技术：核酸分离技术：DNA的分离提取（CTAB法SDS法），RNA的分离提取（CTAB法、异硫氰酸胍法）核酸电泳技术：琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳核酸体外扩增技术：PCR分子杂交技术：Southern杂交（DNA）Northern杂交（RNA）Western印迹（蛋白质）菌落原位杂交5分子杂交：通过各种方法将核酸分子固定在固相支持上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。6Southern杂交：DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后