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一种生物抗氧化剂——α-硫辛酸LesterPacker,*EricH.Witt,*HansJurgenTritschler†*美国加利福尼亚州伯克利市加利福尼亚大学，分子和细胞生物学系，膜生物能研究组†德国法兰克福市，ASTA医学院（1994年10月24日收稿，1994年12月16日修回，1994年12月20日接收）LesterPacker博士是伯克利市加利福尼亚大学分子和细胞生物学系教授。1956年他获得耶鲁大学微生物学和生物化学博士学位。在伯克利，自1961年开始担任生理学教授，伯克利加州大学膜生物能课题组负责人，自1972年成为劳伦斯伯克利实验室高级科学家。在生物氧化反应和生物能量学领域，他的研究重点是氧化剂和抗氧化剂在生物系统中的作用。他是世界上从事维生素E和生物抗氧化剂研究的杰出的研究者之一。他最近的研究工作阐明了维生素E生物化学研究的新领域——维生素E循环。其内容主要与维生素E新的酶学反应，维生素E自由基以及维生素E作用后带来的生物学后果等几个方面有关。近年来的工作关注的是抗氧化剂在生物系统中对氧化损伤的预防，以及维生素E和硫辛酸等抗氧化剂是如何影响基因表达和细胞调控的。这些研究有助于对生物学抗氧化防御机制形成新的更宽泛的理解。Packer博士编写了50多册书籍，撰写了500多篇论文，是科学期刊的8名专业学会会员之一以及3名编委之一，在他从事的研究领域组织了大量的学术会议。目前，他担任加利福尼亚氧气俱乐部主席，国际自由基研究协会主席以及UNESCO分子和细胞生物学全球网络副主席。通讯作者及地址：LesterPacker，美国，加利福尼亚州94720，伯克利市，加利福尼亚大学，LifeSciencesAddition251号摘要——α-硫辛酸在线粒体脱氢酶反应中发挥重要作用，近来它作为一种抗氧化剂，受到人们极大关注。脂酸或其还原型产物二氢脂酸可与过氧化物自由基，羟自由基，次氯酸，过氧化氢以及单线态氧等反应氧簇发生反应。脂酸也可与维生素C以及谷胱甘肽产生相互作用，继而使维生素E再循环利用，从而保护细胞膜。除了具有抗氧化活性外，二氢脂酸也可通过还原铁离子发挥氧化强化剂的作用。在许多氧化应激模型中，给予α-硫辛酸进行治疗已被证实有益，此类模型包括缺血再灌注损伤，糖尿病（硫辛酸和二氢硫辛酸与蛋白均呈疏水性结合，例如与白蛋白结合，可阻止糖基化反应），白内障的形成，HIV激活，神经退行性病变，以及自由基损伤。而且，脂酸还可用作一些蛋白氧化还原反应的调节剂，如肌球蛋白，泌乳素，硫氧还蛋白以及NF-κB转录因子等。我们从如下几个方面对脂酸的特性进行了综述：（1）与反应氧簇发生的反应；（2）与其他抗氧化剂的相互作用；（3）在氧化应激模型或临床状况中发挥的有益效应。关键词——抗氧化剂，二氢脂酸，，二氢硫辛酸，α-脂酸，α-硫辛酸，氧化应激，氧化还原反应调节，综述，硫辛酸，自由基介绍α-硫辛酸的新陈代谢作用为人们所认识已有数十年。它最初是作为一种醋酸取代因子由Reed及其同事分离得到1，2，溶于水，但也溶于有机溶剂。它有多个名字，包括硫辛酸；1，2-二硫戊环基-3-戊酸；1，2-二硫戊环基-3-戊酸以及6，8-二巯基辛酸。α-硫辛酸为硫辛酰胺，它在多酶复合物中的作用为一种辅助因子，可催化α-酮酸类发生氧化脱羧反应，这些酮酸类物质包括丙酮酸，α-酮戊二酸以及支链α-酮酸3。α-硫辛酸分离得到后曾暂时被归为维生素类物质1，4，但后来发现它是由动物和人体合成的5；但是，目前尚未阐明可进行重新合成的完全酶学途径。多项研究表明，辛酸是八碳脂肪酸链的中间体，半胱氨酸可能提供了硫基的来源6。最近，α-硫辛酸及其还原型二氢硫辛酸（DHLA，图1）可能具有抗氧化功能引起了人们极大地关注。在本综述中，我们重点论述了这些化合物的抗氧化特性，以及基于对这一老的辅酶的新鲜认识可能带来的预防和治疗应用前景。抗氧化剂的标准评价一种化合物的抗氧化能力时必须考虑多项标准。其中一些标准涉及化合物的化学性质和生物化学性质：α-硫辛酸二氢硫辛酸图1.α-硫辛酸和二氢硫辛酸的结构，分别为化学结构（上图），球-棒模型（中图），空间填充模型（下图）。图中也显示了天然存在的R-对映体。合成的α-硫辛酸是R-和S-对映体的外消旋混合物。抑制自由基的特性螯合金属的活性与其他抗氧化剂的相互作用对基因表达的影响考虑到疾病预防或治疗用途时，其他标准也非常重要：吸收情况及生物利用度在组织，细胞和细胞外液中的浓度分布（在水相中还是膜结构中，还是两者兼而有之？）一种物质无需满足上述所有的标准才可认定为一种良好的抗氧化剂。例如，维生素E只在膜上或脂质结构域中才发挥作用，其突出的作用是抑制脂质过氧化自由基，对于水相中的自由基的作用微乎其微或根本没有活性，然而，维生素E依然被认为是机体重要的抗氧化剂之一。流行病学研究证实维生素E可以预防许多氧化相关的疾病，例如心脏病7，8。一种“理想的”抗氧化剂应满足上述所有标准。α-硫辛酸/二氢硫辛酸氧化还原对比较接近这种理想状况；它一直被称为“万能抗氧化剂”9。α-硫辛酸易于从食物中吸收。在很多组织中，它迅速转化成DHLA，近来在分析技术方面取得的进展已清楚地证实了这一点10，11。该氧化还原对中的一个组分或两者皆可有效地抑制脂质和水相中的大量自由基。DHLA21，32，33和α-硫辛酸13，19，23，24均具有螯合金属的活性。DHLA可与其他抗氧化剂发生协同作用，说明它能够使其他抗氧化剂从基态或失活态中再生。最后，有证据显示，该氧化还原对调节性蛋白以及参与机体正常生长代谢的基因可能有作用。考虑到这些抗氧化剂的作用，目前开展了大量的实验研究和临床研究，这些研究表明，α-硫辛酸作为一种治疗药物对于下述疾病非常有用或具有潜在应用价值，如糖尿病，缺血-再灌注损伤，重金属中毒，辐射损伤，神经退行性病变以及HIV感染等。抗氧化剂的作用早在1959年，Rosenberg和Culik就发现了α-硫辛酸的抗氧化作用4，他们观察到给予α-硫辛酸能够预防维生素C缺乏型豚鼠的坏血病症状，也能够预防大鼠的维生素E缺乏症状，这些大鼠的饲料中不含α-生育酚。然而，直到最近才开始研究α-硫辛酸和DHLA在自由基淬灭，金属螯合，抗氧化剂再循环以及基因表达等方面的特定作用。反应氧簇淬灭及金属螯合作用硫辛酸人们对于α-硫辛酸的抗氧化作用基本有共识。它能够清除羟自由基，次氯酸和单线态氧。但它不能清除过氧化氢或超氧自由基，可能也不能清除过氧基（表1）。α-硫辛酸可以螯合过渡态金属。两项研究表明α-硫辛酸是一种有效的羟自由基清除剂。在其中一项研究中12，羟自由基由2mMH2O2+0.2mMFeSO4反应生成。利用自旋捕获剂5，5-二甲基喹啉-N-氧化物（DMPO），通过电子自旋共振（ESR）对自由基进行检测。1mMα-硫辛酸可完全消除DMPO-OH的加和物信号。在另外一项研究中13，使用相似的羟自由基生成体系（2.8mMH2O2，0.05mMFeCl3，0.1mMEDTA，以及0.1mM抗坏血酸），但采用了不同的自由基分析方法（脱氧核糖降解法），结果也发现α-硫辛酸是一种羟自由基清除剂。在该研究中，计算得出速率常数为4.7×1010M-1s-1；这基本上是扩散限制的反应速率。因此，α-硫辛酸是一种非常有效的羟自由基清除剂。关于α-硫辛酸清除次氯酸的能力也有类似的共识。Haenen和Bast14以及Scott等13均发现50μMα-硫辛酸几乎可完全消除50μM次氯酸所致的α1-抗蛋白酶的失活。这种表现与谷胱甘肽的作用大不相同，谷胱甘肽的还原型是非常有力的次氯酸清除剂，作用与α-硫辛酸相当，但是其氧化型几乎完全无效14。该研究的作者推测，α-硫辛酸相比氧化型谷胱甘肽的表现出更高的反应性可能与其分子内二硫化物结构中五元环略显紧张的构象有关系；在谷胱甘肽的分子内二硫化物结构中没有这样的张力，这一点或可解释在该系统中谷胱甘肽反应性不足的问题。目前发现，α-硫辛酸至少在四个不同系统中可以清除单线态氧。两项早期的研究表明，α-硫辛酸可与红荧烯自动氧化15或亚甲基感光氧化16生成的单线态氧发生反应；这些实验在有机溶剂中开展。后来在更接近生理条件下进行的研究也证实α-硫辛酸是一种有效的单线态氧清除剂。Kaiser等17通过内过氧化物散热作用产生单线态氧，并通过化学发光法进行检测。在该系统中，α-硫辛酸与单线态氧发生反应，速率常数为1.38×108M-1s-1。还有一些实验利用内过氧化物散热作用产生单线态氧，并通过单链DNA断裂进行检测，在这些系统中也证实α-硫辛酸是一种单线态氧清除剂18，19。早期的化学研究也表明α-硫辛酸能够与过氧化氢发生反应20。只是在这些研究中使用的是高浓度的过氧化氢（30%）以及在非生理条件下进行（例如在丙酮中进行一天反应）。当α-硫辛酸与过氧化氢在水溶性环境中进行测试时13，没有发生反应，实验采用基于过氧化物酶的分析系统检测过氧化氢，α-硫辛酸的测试浓度最高达6mM。两项独立的研究均未证实α-硫辛酸可以清除超氧自由基。两项研究均利用黄嘌呤或次黄嘌呤以及黄嘌呤氧化酶产生超氧自由基。其中一项研究利用自旋捕获剂DMPO，通过电子自旋共振（ESR）对超氧自由基进行检测12，未见反应（图2）。无独有偶，Scott等人利用细胞色素c还原反应检测超氧化物，同样也发现α-硫辛酸没有作用。表1α-硫辛酸的抗氧化作用氧化剂能否被α-硫辛酸清除？试验系统参考文献超氧自由基不能不能通过黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶产生超氧阴离子，利用自旋捕获剂以电子自旋共振法进行检测通过次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶产生超氧阴离子，通过超氧阴离子依赖的细胞色素c还原法进行检测1213过氧化氢不能直接加入过氧化氢并通过过氧化物酶分析系统进行检测13羟自由基可以可以利用H2O2+FeSO4反应生成羟自由基，利用自旋捕获剂通过电子自旋共振对自由基进行检测，或利用氨基苯二酰肼通过化学发光法进行检测利用H2O2+FeCl3+抗坏血酸生成羟自由基，通过脱氧核糖降解法进行检测。反应速率常数=4.71×1010M-1s-11213次氯酸自由基可以可以直接加入次氯酸并通过影响α1抗蛋白酶活性进行检测同上1413过氧基不能可以利用2，2’偶氮（2-甲基丙基脒）-二盐酸盐（AAPH）在水溶性介质中生成过氧基，通过藻红蛋白荧光淬灭法进行检测。在脂质（脂质体或大鼠肝脏微粒体）中，通过2，2’偶氮（二异庚腈）（AMVN）的热解反应生成过氧基。通过线性加速器生成CCl3O2-并利用分光光度法进行检测。反应速率常数为1.8×108M-1s-1913单线态氧可以可以可以可以在空气饱和苯中，于546nm处激发，由红荧烯自动氧化生成单线态氧，根据随后红荧烯光谱消失进行检测。反应速率常数=1×108M-1s-1，未对DHLA进行试验。在氯仿或甲醇中由亚甲基感光氧化生成单线态氧；通过分析硫辛酸甲酯的氧化产物检测反应情况。未对DHLA进行试验。通过内过氧化物散热作用产生单线态氧，并通过化学发光法进行检测。在该系统中，α-硫辛酸与单线态氧发生反应的速率常数=1.38×108M-1s-1。利用内过氧化物散热作用产生单线态氧，并通过单链DNA断裂进行检测15161718，19过渡金属螯合剂在水溶液中α-硫辛酸能够与Mn2+，Cu2+，Zn2+形成稳定的复合物。Bisnorlipoate和tetralipoate可与23螯合剂可能为螯合剂没有螯合作用螯合剂螯合剂离子形成更加稳定的复合物与测试单线态氧的系统相同。当向系统中加入EDTA时，α-硫辛酸的保护作用降低，说明其保护效应至少部分是通过金属螯合作用达到的。α-硫辛酸在肝细胞中能够降低Cd2+诱导的毒性，但效能远不及DHLA。作者推测硫辛酸被摄取并转化为DHLA，后者才是发挥保护效应的化合物在大鼠肝脏微粒体+硫酸亚铁+抗坏血酸中，硫辛酸对于TBARS的蓄积没有作用α-硫辛酸能够抑制铁离子诱导的脱氧核糖的位点特异性降解，说明硫辛酸能够螯合铁离子。降低铜离子催化的抗坏血酸氧化反应，增加铜离子由水相转入正辛醇中的比例，抑制铜离子诱