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实验四微生物接种方法及微生物测量方法实验目的与要求强调无菌操作概念，掌握无菌操作技术掌握微生物移植、纯化的基本方法了解不同微生物在同一培养基上的培养特征，及同一微生物在不同培养基上的培养特征掌握几种常用的鉴别、选择培养基的使用了解显微测微尺的构造；掌握应用显微测微尺测量微生物细胞大小的方法与技术微生物培养Culture：在一定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体混合培养物：含有多种微生物的培养物；纯培养物：只有一种微生物的培养物；Pureculture通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果纯培养技术是进行微生物学研究的基础！一、用固体培养基分离纯培养培养基：液体培养基；固体培养基；1.5%-2.5%半固体培养基；0.2%-0.75%琼脂一、用固体培养基分离纯培养菌落（colony）：单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体众多菌落连成一片菌苔（lawn）无菌操作：火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据菌落的描述：形态、表面和边缘特征同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落一、用固体培养基分离纯培养使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的基本方法：1、稀释倒平板法2、涂布平板法3、平板划线法4、厌氧微生物的分离一、用固体培养基分离纯培养1、稀释倒平板法2、涂布平板法操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！利用L棒进行涂布3、平板划线法3、平板划线法二、选择培养分离抑制大多数其它微生物的生长；使待分离的微生物生长更快；对微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。三、选择培养分离1.利用选择平板进行直接分离待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制高温下培养：分离嗜热细菌；培养基中不含N：分离固氮菌；培养基加抗生素：分离抗性菌；1.利用选择平板进行直接分离颜色反应：分离特定的菌株；牛奶平板：分离蛋白酶产生菌；待分离的微生物的生长特征明显不同于其它微生物常用的选择培养基沙门菌常用的培养基：亚硫酸铋琼脂平板(BS):含有煌绿、柠檬酸铋铵、亚硫酸钠、硫酸亚铁，具有强选择性，分离沙门氏菌HE（Heetoen)：柠檬酸铁铵、去氧胆酸盐、硫代硫酸钠、麝香草酚蓝和复红，分离肠道致病菌麦康凯培养基乳糖、胆盐，弱选择性，中性红,分离肠道致病菌中性红指示剂pH感应范围6.8（红色）到8.0（黄色）分解乳糖产酸，菌落颜色呈红色沙门氏菌、志贺氏菌不分解乳糖，菌落颜色与培养基相同胆盐有助于沙门氏菌的生长，抑制其他细菌大肠杆菌？沙门氏菌？常用的选择培养基克氏双糖铁蛋白胨；牛肉膏；酵母膏；乳糖；葡萄糖；氯化钠；柠檬酸铁铵；硫代硫酸钠；琼脂；酚红为指示剂，黄色为产酸，红色为产碱观察克氏双糖接种后斜面、底层产酸、产气、产H2S的情况，大肠杆菌斜面？沙门氏菌斜面？接种划线菌种：大肠杆菌、沙门菌、青霉采用无菌操作进行移植学会分区划线所有平皿和试管必须有标记18－24小时（真菌下周观察）观察试验结果，描述固体培养和液体培养的细菌培养特征步骤两个人为一组，一个接种大肠杆菌，一个接种沙门菌LB液体移植普通琼脂：分区划线麦康凯：分区划线LB半固体培养基：穿刺接种克氏双糖：先穿刺后接种斜面真菌（青霉）接种沙保劳氏培养基微生物大小测量原理微生物细胞的大小是其形态特征之一，也是鉴定的依据之一。在研究工作中有时要测定显微镜下微生物细胞的大小，使用工具为显微测微尺。显微测微尺有镜台测微尺和目镜测微尺。目镜测微尺是一块可放在目镜内的园形玻片。在玻片中央把5mm长度，刻成100等分的小格，其目镜测微尺经过镜筒光学系统后，其每格尺寸随镜筒长度变化而变化，也随放大倍数而变化，因此必须选定显微镜及放大倍数。然后用已知长度的镜台测微尺来校准，计算出物镜下接目测微尺每小格的长度。然后才可用接目测微尺直接测量标本的长度和宽度。镜台测微尺是一中央部分刻有精确等分线的载玻片，其每格长度为10um，是专用于校正目镜测微尺每格长度的。操作步骤1，先将目镜测微尺装入目镜中，方法是：先拨出目镜，旋下目镜上的透镜，然后将目镜测微尺的刻度朝下，旋好目透镜，并装上镜筒。2，将镜台测微尺放在载物台上，刻度朝上，观察。3，先低倍再高倍观察，旋转目镜测微尺，使其刻度与镜台测微尺刻度线平行。移动载物台推动器使目镜测微尺的0点与镜台测微尺的一条刻度线重合，然后于另一端找重合线，计算两端重合线之间目镜测微尺和镜台测微尺各有几格，重复三次，按公式计算出目镜测微尺每格实际长度。目镜测微尺每格长度（微米）=（镜台测微尺两重合线格数×10）/目镜测微尺两重合线格数4，取出镜台测微尺，取酵母菌悬浮液1滴于载玻片上，盖上盖玻片，放在载物台上，进行测量菌体的大小（测20个菌体，求平均值）。思考题1、无菌操作的关键步骤包括有哪些？2、大肠杆菌和沙门菌在麦康凯培养基上的菌落特征各是什么？为什么？3、分区划线的目的是什么？4、接种真菌的培养基有何特殊要求？下次实验请各位同学认真预习以下内容：微生物的快速生化鉴定水中大肠菌群的测定