11 环境微生物检测

第11章环境微生物检测11.1空气中微生物的检测与控制11.1.1空气中微生物的检测方法(1)撞击法撞击法是采用撞击式空气微生物采样器，通过抽气动力作用，使空气通过狭缝或小孔而产生高速气流，使悬浮在空气中的带菌轮子撞击到转动的营养琼脂培养基平皿上。经37℃、48h培养，计算出每立方米空气中所含的细菌菌落数。(2)自然沉降法自然沉降法是靠重力的作用将空气中携带微生物的悬浮颗粒沉陷到直径9cm的营养琼脂培养基平皿上，经37℃，48h培养后计生长的细菌菌落数。由于沉降法是被动采样，会造成很大的误差。通过前苏联奥梅梁斯基公式换算出。通常设置5个采样点，即室内墙角对角线交点为1个采样点，该交点与四墙角连续的中点为另外4个采样点。采样高度为1.2～1.5m。采样点心远离墙壁1m以上，并避开空调、门窗等空气流通处。检测点数越多越准确，以20～30个测点数为宜，最少测点数为5～6。(3)过滤法过滤法是在负压下抽滤空气，使空气通过经灭菌的微孔滤膜，空气中细菌被截留在膜上，然后将膜转移到培养基上，使滤膜与培养基完全贴紧，倒置于37℃恒温箱培养24h。通过计平板上的菌落数，测定空气中细菌的数量。空气中微生物总数目前用CFU／m3，计量。即每立方米空气落下的细菌数，一般以室内空气中细菌总数500－1000CFU／m3以作为空气污染指标。11.1.2空气微生物污染的控制控制空气微生物污染，必须减少空气中微生物的来源，特别是微生物污染严重的医院，肉类加工等行业废水废物的处理消毒工作；搞好室内外环境卫生。减少微生物滋生；绿化造林也是净化市气、除尘、杀菌和吸收有害气体的重要途径；另外空气消毒和空气净化器对净化空气也起一定的作用。日本建议的评价空气清洁程度的标淮见表11.2水的微生物检测及控制11.2.1水质的细菌学检测我国《生活饮用水卫生标准》GB5749-85关于饮用水中的细菌标准与大肠菌群数量标准为1．细菌总数≤100个/ml2．大肠菌群≤3个/L一、伤寒杆菌病症：伤寒或副伤寒。表现：持续发烧，牵涉到淋巴组织，脾脏肿大，躯干上出现红斑，胃肠壁溃疡产生腹泻。伤寒沙门氏菌二、痢疾杆菌痢疾杆菌可引起细菌性痢疾(与阿米巴痢疾不同)，症状为急性腹泻，通常大便中有血及粘液，某些病例中有发烧。三、霍乱弧菌病症：霍乱症状：轻型病例中，只造成腹泻。在较严重或较典型的病例中，除腹泻外，症状还包括呕吐、“米汤样”大便、腹疼和昏迷等。病程短，严重的常常在症状出现后12h内死亡。电镜照片使用的是结晶紫单染色，若革兰氏染色则为阴性红色四、寄生虫真菌一般通过接触传染，不通过水传播，引起疾病的原生动物和小型后生动物也由水传播，通常称为寄生虫。在目前发现的几千种原生动物中只有20种能引起人类疾病传播方式：除了饮水不卫生外，更多的是通过食物以及昆虫血液传播如疟疾是蚊子传播，食用生肉感染肉类寄生虫等11.2.2水质指示微生物——大肠菌群大肠菌群是人肠道中正常的寄生菌，是一群需氧和兼性厌氧的，能在37℃，24h内使乳糖发酵产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌，又称总大肠菌群。大肠菌群作为水体被粪便污染的指标，也是饮水、食品等的细菌学常规检验指标之一，通常用“大肠菌群指数”和“大肠菌群值”表示。这些寄生菌通常与人体构成互利共生关系，当人体免疫力下降时，他们则有可能成为引起肠炎的致病菌，他们中的个别变种还会变为极具毒性的病菌。如大肠埃希氏菌可引起幼儿腹泻，引起美国和日本传染病流行的O-157也是大肠埃希氏菌的变种菌株。中国水质标准中规定的大肠菌群数(个／L)饮用水≤3游泳池水≤100地表水第一级≤500第二级≤10000第三级≤5000011.2.2.1大肠菌群检测的目的和原理(一)生理习性与肠道病原菌类似，即在外界的生存时间基本一致；（代表性）(二)在粪便中的数量较多；（比病原菌多，不会漏检）(三)检验技术较简单;（操作方便）11.2.2.2大肠菌群的检测方法常用的大肠菌群的检测方法有多管发酵法与膜滤法。1．多管发酵法（即最大可能数法，MPN）发酵法是大肠菌群测定的国家标准方法。分为三步。A．初发酵目的：水中大肠菌群存在与否的初步判断。A.初发酵方法为将水样置于糖类液体培养基中，在一定温度下，经一定时间培养后，观察有无酸和气体产生，即有无发酵，而初步确定有无大肠菌群存在。如采用含有葡萄糖或甘露醇的培养基，则包括副大肠杆菌；如不考虑副大肠杆菌，则用乳糖培养基。由于水中除大肠菌群外，还可能存在其它发酵糖类物质的细菌，所以培养后如发现气体和酸并不一定能肯定水中含有大肠菌群，还需根据这类细菌的其它特性进行下两阶段的检验。试验中的培养基中加入了酸碱指示剂紫色的溴甲酚紫，产酸时指示剂变黄，同时培养基中口朝下放置了装满同样培养基的小试管，产气时小试管中会封闭一段气体，被作为培养中是否产气的依据。目的：鉴定产酸产气菌的染色特征、好氧与否、芽孢特征。根据：大肠菌群在固体培养基上可以在空气生长，革兰氏染色呈阴性和不生芽孢的特性B.平板分离远藤氏培养基出现特征不符合划线分离单菌落菌落特征菌落阳性阴性结论：无大肠菌群菌落革兰氏染色阳性阴性结论：无大肠菌群复发酵在此阶段，先将上一试验产酸的菌种移植于品红亚硫酸钠培养基(远藤氏培养基)或伊红美蓝培养基表面（划线接种是为了分离出单菌落，防治菌落不纯干扰结果），这一步氧气可以阻止厌氧芽抱杆菌的生长，而上述培养基所含染料物质也有抑制许多其它细菌生长的作用。C.复发酵目的：验证将可疑的菌落再移植于糖类培养基中，观察其是否发酵，是否产酸产气，最后肯定有无大肠菌群存在。对于自来水厂出水，初步发酵试验一般都在10个小发酵管和2个大发酵管(或发酵瓶)内进行，复发酵试验则在小发酵管内进行。根据肯定有大肠菌群存在的初步发酵试验的发酵管或瓶的数目及试验所用的水样量，即可利用数理统计原理，查表得出结果。（2）膜滤法使用的滤膜是孔径为0.45～0.65μm的微孔滤膜；转移至伊红美兰平板上。11.2.3水微生物污染的控制控制水体微生物的污染首先必须从源头做起，即控制排放废水，尤其是医院废水等微生物的含量,避免大量有害微生物进入水体；其次，消除微生物兹生的环境。净化水体，对地表水、游泳池水要进行定期检测，必要时加入消毒剂以杀灭微生物。11.3发光细菌的微毒检测发光细菌法是20世纪70年代后期提出的一种微生物检测环境水质毒性的新方法。发光细菌法简便、快速、灵敏、精度高，凡有毒化合物、废水、废物的生物毒性均可测定。发光细菌法已被中国国家环境保护总局规定为测定水环境急性毒性的国家标准。11.3.1发光细菌检测的原理细菌的发光过积是菌体内一种新陈代谢的生理过程。菌体含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要素，在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系，发光细菌法就是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对细菌发光强度的抑制程度进而反映环境中毒物毒性大小，用发光度表征毒物所在环境的急性毒件。11.3.2发光细菌法检测的操作目前国内外发光细菌的测定常用的有两种方法。①新鲜发光细菌培养测定法即将发光菌接种于液体培养基中，在适当条件下(20±0.5)℃振荡培养到对数生长期，配制含3％NaCl盐度的适当浓度的菌悬液加入测试管中，再加入待测液，使之与菌液接触，作用5～15min后，读出并记录对照管和样品管发光强度。此法操作较为简便。②冷冻干燥发光细菌制剂测定法即把培养到对数生长期的发光细菌，以冷冻干燥法制成干粉剂，使用时加入冷的2％NaCl溶液复苏，使其恢复到原来的生理状态和发光水平，然后用于测定。这是国家标准方法，其优点是可实行测定的质量控制。冻干粉可长期保藏方便使用，操作简便，节约时间。11.3.3发光细菌法的应用①在水质监测中的应用②在工业废水、固体废物、废气的急性毒性检测中的应用③对重金属急性毒性效应的测定和评价④对化学品的毒性评价和安全性评价11.4污染物致突变性检测（Ames）试验该试验是通过测定有污染物存在时鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)的组氨酸营养缺陷型(his-)菌株发生回复突变的概率来判断污染物的致癌、致突变效应。其阳性结果与致癌物吻合率高达83％。列为评价化学物质安全性的首选力法。11.4.1Ames试验的原理和方法鼠伤寒沙门菌的组氨酸营养缺陷型菌株，在不含组氨酸的培养基上不能生长。但当受到致突变物作用后，大量细胞在遗传物质的特定座位发生基因回复突变而成为野生型，能自行合成组氨酸，此时培养物中虽不含组氨酸。组氨酸缺陷型菌株亦能生长并形成菌落。Ames试验就是通道在培养物中加入待测物，根据不含组氨酸的培养基上组氨酸营养缺陷型茵株长出回复突变菌落数目的多少判断待测物的致突变性。(1)试验菌株采用鼠伤寒沙门菌变异株TA97，TA98，TAl00，TAl02四种菌种，又增加了TA1535，TA1537，TA1538共七株。(2)试剂牛肉膏蛋白陈培养基牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g．Nacl5.0g,水1000mL.pH7.2~7.4S9mix大鼠肝匀浆S9与NADP、G-6-P、KCl、Na2HPO4、KH2PO4和水配成混合液。(3)菌种鉴定在试验之前都要进行全面的生物学特性和敏感性鉴定，符合要求才能使用。①脂多糖屏障丢失判定是否是缺陷型②R因子判断菌体是否存在或失去了某种抗药性质粒。③紫外线损伤修复缺陷④自发回变⑤回变特性——诊断性试验⑥组氨酸营养缺陷型(4)操作方法Ames试验的典型操作方法有平板掺入试验和斑点试验两种。11.4.2Ames试验的应用①检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌性。②检测水源水和饮用水的致突变性，探索较现行方法更加卫生安全的消毒措施。③检测城市污水和工业废水的致突变性，结合化学分析，追踪污染源，为研究防治对策提供依据。④检测土壤、污泥、工业废物堆肥、废物灰烬的致突变性。以防止维系生命的土壤受致突变物污染后，再通过农作物危害人类。⑤检测气态污染物的致突变性，防止污染物经出大气，通道呼吸对人体发生潜在危害。⑥研究化合物结构与致突变性的关系。为合成对环境无潜在危害的新化合物提供型论依据。⑦检测农药在微生物降解前后的致突变性，了解农药在施用后代谢过程中对人类有无隐患。⑧筛选抗突变物，研究开发新的抗痛药。抗诱变因素在抗癌作用上至关重要、随着遗传毒理学的发展，通过筛选已发现天然食物如蔬菜类、茶叶、中草药等都员有抗诱变作用。11.5生物传感器11.5.1生物传感器的定义与分类传感器是能感受特定的被测量的物质并按照一定规律将其转换成可用信号的器件或装置。生物传感器是用固定化生物成分或生物体作为敏感元件的传感器。生物传感器的分类主要有三种方式。①根据生物传感器中分子识别元件即敏感元件可分为五类：酶传感器、微生物传感器、细胞传感器、组织传感器和免疫传感器。②根据生物传感器的换能器即信号转换器分类有：生物电极传感器、半导体生物传感器、光生物传感器、热生物传感器、压电晶体生物传感器等。③以被测目标与分子识别元件的相互作用方式进行分类有：生物亲和型生物传感器和代谢型或催化型生物传感器。三种分类方法之间互相交义，相互渗透。11.5.2生物传感器基本结构和工作原理生物传感器通常由敏感元件(生物分子)、转换元件及相应的机械结构和电子线路所组成，它以生物分子所发生的物理或化学变化转化为相应的电信号予以放大输出，从而得到检测结果。生物传感器的工作原理主要有以下几种：(1)将化学变化转变成电信号(2)将热变化转换成电信号(3)将光信号转变为电信号(4)直接产生电信号方式11.5.3生物传感器在环境检测中的应用(1)BOD生物传感器应用BOD传感器完成样品的测定，一般在10～30min，比传统法的测定时间大为缩短。(2)测定氨生物传感器(3)亚硝酸盐生物传感器(4)致突变物传感器(5)急性毒性发光细菌生物传感器11.6PCR技术在环境检测中的应用聚合酶链反应（PCR）是近年来分子生物学领域中迅速发展和广泛应用的一种技术。PCR技术能快速、特异地在体外扩增所希望的目的基因或DNA片段，是