120301 医学分子生物学-1

基础医学与医学技术学院细胞与分子诊断学系钱晖[e-mail]而当你走进实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象。否则，你对事物的观察就会受影响。当你翻开书本的时候，必须尽可能展开想象的“翅膀”。否则，你就不可能走在别人前面！－－理论学习－－实验操作研究生的学习理论知识－基础实践能力－平台理论指导实践实践拓展理论能力的提升创新思维，分析问题，解决问题，……科学研究的成功之路Work（hard）NetworkJudgementlucksuccess《论语·为政》：学而不思则罔，思而不学则殆Will(idea)科学研究系统性连续性完整性......宏观－微观：个体，组织，细胞，分子，基因分子生物学(molecularbiology)从分子水平去研究生命现象，并在分子水平上改造和利用生物的一门新兴学科。理论+实践生物大分子(biomacromolecule)核酸(nucleicacid)蛋白质(protein)糖复合物脂类生物大分子(biomacromolecule)核酸:核苷酸（碱基，核糖，磷酸）DNARNA(mRNA,tRNA,rRNA,siRNA,miRNA……)蛋白质:氨基酸遗传因子《基因论》(1926年)1933年获诺贝尔医学或生理学奖在一次国际遗传学大会上，有人问他为什么会有这么多的发现，摩尔根回答：“一靠勤奋、二靠实验材料得当，三靠愿意放弃任何没有证据的假说，最后还得靠少开些遗传学大会”。威尔金斯DNAX射线1962年诺贝尔生理学或医学奖得主克里克FrancisHarryComptonCrick英国剑桥分子生物学研究所1916年--沃森JamesDeweyWatson美国哈佛大学1928年--威尔金斯MauriceHughFrederickWilkins英国伦敦大学1916年--发现了核酸的分子结构（DNA双螺旋）及其在遗传信息传递中的作用1959年诺贝尔生理学或医学奖得主奥乔亚SeveroOchoa美国纽约大学1905年--1993年科恩伯格ArthurKornberg美国斯丹福大学1918年--发现了RNA和DNA的生物合成机理-碱基配对中心法则(TheCentralDogma)转录翻译逆转录复制核酸——储存和传递遗传信息蛋白质——构成生物体的基本组分，执行各种生理功能1965年诺贝尔生理学或医学奖雅各布FrançoisJacob法国巴黎巴斯德研究所1920年--尔沃夫AndréLwoff法国巴黎巴斯德研究所1902年--1994年莫诺JacquesMonod法国巴黎巴斯德研究所1910年--1976年发现了酶和病毒的合成的遗传调节大肠杆菌乳糖操纵子★基因表达调控雅各布FrançoisJacob（1920-，法国）1939年，巴黎医学院，立志当名外科医师；1940年，加入了自由法国部队，被派到非洲任军医；1944年，在诺曼底身受重伤，获得二战中法国最高军事勋章-解放十字勋章；1947年，医学博士；1954年，巴黎大学理学博士；1950年，进入了巴斯德研究所，1965年获诺贝尔医学奖；2005年，发现橙花酵素，获诺贝尔奖提名；在失去了人生最重要的东西——健康之后,如果你能改变初衷,选择适合自己的事业,那么,你有可能获诺贝尔奖。是对人类健康的关注鼓舞着我，我必须为了人类的健康用尽我所有的努力，这是道义和责任。2011年诺贝尔生理学或医学奖美国科学家布鲁斯·博伊特勒、法国科学家朱尔斯·霍夫曼和加拿大科学家拉尔夫·斯坦曼免疫学领域：受体/树突状细胞分子生物学与医学治病救人1）判断能力-正确的诊断；-疾病治疗的基础两方面技能：诊断+治疗2）治疗能力-正确治疗方案与手段分子诊断（moleculardiagnosis）采用分子生物学方法，从DNA水平或RNA水平检测分析基因的存在和变异，并进一步从转录（mRNA）或翻译水平（蛋白质）分析基因的表达与功能，从而对人体状态与疾病作出诊断。病因学诊断基因病分子诊断-第四代实验室诊断技术限制性酶谱分析诊断指标的选择；诊断结果的判定；原位杂交技术－筛选21三体（间期）13号染色体（绿）和21号染色体（红）探针与羊水间期细胞杂交，可见两个绿色信号和三个红色信号，说明是21三体。分子诊断分子生物学技术的临床应用PCR技术分子诊断丙型肝炎2）治疗能力-正确治疗方案与手段基因工程基因治疗腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID)病因:淋巴细胞缺乏ADA腺苷、dATP堆积破坏免疫功能患儿很少活到成年第一例基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH)基因治疗转基因技术克隆与“动物药厂”核酸水平（DNA,RNA)------核酸的分离纯化;PCR技术；分子杂交；分子克隆；RNA干扰；基因芯片；DNA测序等；蛋白水平------蛋白分离纯化；WesternBlot;蛋白芯片等；蛋白质与核酸相互作用凝胶滞后实验；染色体免疫沉淀；DNAaseI足纹分析；Southwestern杂交；蛋白质与蛋白质相互作用酵母双杂交；蛋白质免疫共沉淀；分子生物学常用技术TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine：1978年Arber等限制性核酸内切酶的发现2006年Fire，MelloRNA干扰2007年Smith等基因打靶TheNobelPrizeinChemistry：1958年Sanger胰岛素序列测定1980年Sanger等双脱氧链终止法测序1993年Mullis聚合酶链反应（PCR）M.Smith寡聚核苷酸定点诱变技术课程主要内容第一章生物大分子的分离纯化第二章分子生物学常用技术（PCR、核酸分子杂交、基因测序、生物芯片等）第三章基因工程第四章基因敲除与RNA干扰第五章细胞培养技术核酸和蛋白质的结构与功能及相互作用是分子水平生命活动的基础；内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致病基因的侵入是人类疾病发生、发展的根本原因。生物大分子是指生物体内由分子量较低的基本结构单位首尾相连形成的多聚化合物。第一章生物大分子的分离纯化核酸（DNA，RNA）和蛋白质是生物体中最重要的生物大分子，是分子生物学研究和分子诊断的对象。核酸和蛋白质的分离纯化是分子生物学研究及对疾病进行分子诊断的最基础工作。核酸的化学组成核酸（RNA、DNA）核苷酸磷酸核苷戊糖碱基核糖（RNA）脱氧核糖（DNA）A、G、C、UA、G、C、T碱基腺嘌呤鸟嘌呤NNNHN123456789嘌呤嘧啶尿嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶NNH132456碱基胞嘧啶核苷尿嘧啶核苷鸟嘌呤核苷腺嘌呤核苷NNOHHONNNH2HONNOHH2NNNNNNNNH2OHHOHHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHOHHOHHOHHOHHHOCH2OHHOHHOHHHOCH2如果是存在于DNA中的脱氧核苷则2’位则是H而不是OH核苷磷酸+戊糖+碱基=核苷酸POOOHOHOCH2OHOHNNNH2OOHOCH2OHOHNNNH2OO-POO-NNNNNH2OHHOHHOHHOCH2O-POO-O-POO-三磷酸腺苷(ATP)NTP，NDP，NMPdNTP，dNDP，dNMP磷酸二酯键DNA和RNA的一级结构RNA序列5’-pAAUUCGAUCGAAGGCGCCGGUU-3’DNA序列5’-pAATTCGATCGAAGGCGCCGGTT-3’3’-TTAAGCTAGCTTCCGCGGCCAAp-5’核苷酸链（一级结构）3'，5'–磷酸二酯键3末端(游离羟基)5末端(游离磷酸基)DNA的双螺旋结构特征：①两条链以反向平行的方式围绕同一中心轴向右盘绕②主链处于螺旋的外侧（核糖+磷酸）亲水核糖平面与螺旋轴平行碱基处于螺旋的内侧，与中轴垂直③螺距：10bp—3.4nm—3600đ=2nm④大沟与小沟：蛋白质识别DNA的特定遗传信息的关键点⑤碱基互补配对A=T,C≡G核酸变性在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。变性复性核酸的变性、复性碱基配对A＝T，C≡G一级结构不变；氢键；碱基堆积力；核酸的变性与复性变性，解链温度或融解温度（meltingtemperature，Tm）复性，淬火（quench）与退火（annealing）50％的DNA变性第一节核酸分离纯化的设计及原则第二节真核细胞基因组DNA的分离纯化第三节质粒DNA的提取与纯化第四节真核细胞RNA的分离纯化一、核酸的分离纯化DNARNA核酸的一般理化性质多元酸，具较强的酸性。DNA是线状高分子，粘度很大，碱性条件下稳定；RNA分子较小，粘度也小，对酸稳定。核酸分子在机械力的作用下易发生断裂。碱基有共轭双键，具紫外吸收特性，最大吸收峰在260nm。可对核酸进行检测和定量，也可分析纯度。核酸变性——加热、极端的pH、有机溶剂如甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等。第一节核酸分离纯化的设计及原则核酸分离纯化的原则核酸的释放,核酸的浓缩、沉淀与洗涤核酸的鉴定方法（浓度，纯度，完整性）核酸的保存材料与方法的选择临床诊断与研究常见的标本——血液、尿液、唾液、组织及培养的细胞。不同研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同要求，另外尚需考虑制备核酸所需的时间与成本。不影响核酸制品质量与产量的前提下，应选安全的试剂与制备方案。核酸分离纯化的原则：一保持核酸一级结构的完整性,因完整的一级结构是核酸结构和功能研究的最基本的要求；二是尽量排除其他分子的污染，保证核酸样品纯度。核酸提取－－溶于水而不溶于有机溶剂的性质保持核酸的完整性（一）尽量简化操作步骤，减少对核酸的破坏；合适pH值（pH4－10）过酸或过碱－破坏磷酸二酯键减少机械剪切力，包括剧烈的溶液振荡、搅拌，使溶液快速通过狭长孔道，细胞突置于低渗溶液中，DNA样品反复冻融等都可引起DNA的降解；低温操作；保持核酸的完整性（二）抑制核酸酶活性与反应速率，减少对核酸的生物降解：内源或外源的各种核酸酶能破坏磷酸二酯键；DNA酶的激活需要Mg2+、Ca2+等二价金属离子，可使用二价金属离子螯合剂乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）、柠檬酸盐并在低温条件下操作，基本可抑制DNA酶的活性；RNA酶，分布广泛，耐高温、耐酸碱，不易灭活。技术路线的设计核酸的释放DNA和RNA一般均位于细胞内（病毒除外），分离纯化的第一步是裂解细胞、释放核酸。破碎细胞的方法：包括机械和非机械法（干燥法，溶胞法）两大类。非核酸的大分子污染物－－主要是蛋白质、多糖及脂类物质；非需要的核酸分子－－分离某一特定的核酸分子时，其它的核酸分子皆为杂质；影响后继研究的溶液和试剂－－加入的有机溶剂和某些金属离子；应清除的杂质核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀是浓缩核酸的最常用且高效的方法，其优点在于沉淀后易于调整核酸溶液浓度。另外还能清除部分杂质和某些盐离子。原理：核酸在水溶液中以多聚阴阳离子的化合物形式存在，它与K+、Na+、Mg2+、Li+及NH4+等阳离子形成的盐，通过屏蔽带负电的磷酸基团使DNA、RNA分子聚集在一起而不溶于许多有机溶剂。核酸的沉淀与洗涤常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁；常用的有机溶剂为乙醇、异丙醇和聚乙二醇。核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除。核酸的鉴定与保存1.浓度测定紫外分光光度法/荧光光度法紫外分光光度法：基于核酸分子中的碱基具有共轭双键结构因而可吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。这一物理特性为溶液中核酸浓度的测定奠定了基础。双链DNAA260=50µg/ml；单链DNA或RNAA260=40µg/ml；单链寡核苷酸A260=33µg/ml；1.浓度测定荧光光度法：核酸的荧光染料如溴化乙锭（ethidiumbromide－EB），SybrgreenI等嵌