12生物质谱

生物质谱吉林大学生命科学学院课程简介课程简介质谱概述•质谱概述•质谱构造与分类•认识质谱图认识质谱图•质谱应用领域（药物、蛋白、DNA）什么是质谱？质谱是种与光谱并列的谱学方法通常意义上是指通过制备分离检质谱是一种与光谱并列的谱学方法，通常意义上是指通过制备、分离、检测气相离子来鉴定化合物的一种方法。质谱分析是一种测量离子质荷比（质量电荷比）的分析方法其基本原质谱分析是一种测量离子质荷比（质量‐电荷比）的分析方法，其基本原是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。用途：a)样品元素组成；b)无机、有机及生物分析的结构;c)复杂混合物的定性定量分析；d)固体表面结构和组成分析；e)样品中原子的同位素比。定性定量分析；d)固体表面结构和组成分析；e)样品中原子的同位素比。质谱技术发展过程质谱技术发展过程2020世纪初世纪初J.J.Thomson制成第一台质谱仪主要是用来进行同位素测定和无机元素分析2020世纪世纪4040年代年代开始用于有机物分析2020世纪世纪6060年代年代出现了气相色谱-质谱联用仪2020世纪世纪6060年代年代成为有机物分析的重要仪器2020世纪世纪8080年代年代质谱新技术：电喷雾电离源，大气压化学电离源液相色谱-质谱联用仪感应耦合等离子体质谱仪质谱分析应用领域质谱分析应用领域医药学：药物代谢、药代动力学、杂质分析、天然产物分析生物化学：多肽、蛋白、核苷酸、糖生物化学：多肽、蛋白、核苷酸、糖环境分析：农药农残分析、有机污染物、土壤/水临床医学：新生儿筛查、胆酸、糖化血红蛋白(糖尿病)临床医学：新生儿筛查、胆酸、糖化血红蛋白(糖尿病)食品科学：香料、添加剂、包装、蛋白、致癌物法医学：滥用药物、爆炸物、兴奋剂兽医学：磺胺类药物有机化学：染料、表面活性剂、有机金属化合物、反应中间体无机化学：无机金属离子无机化学：无机金属离子瘦肉精——盐酸克伦特罗多宝鱼——硝基呋喃类代谢物红心鸭蛋——苏丹红Ⅳ号桂花鱼孔雀石绿北美虾、海参、海蜇也“嗑药”桂花鱼——孔雀石绿龙口粉丝“吊白块”甲醛次硫酸氢钠龙口粉丝——吊白块-甲醛次硫酸氢钠……重金属、塑化剂、二甘醇（DEG）质谱构造1离子源1.离子源作用：质谱的进样器，将样品分子传送到质谱仪工作方式：产生气态的带电荷的分子离子常见类型电喷雾(ESIelectrosprayionization)和常见类型：电喷雾(ESI‐electrosprayionization)和基体辅助激光解吸(MALDI‐matrix‐assistedlaserdesorption/ionization)2质量分析器2.质量分析器作用：将气化的离子根据质荷比进行分离在串联质谱中起到离子选择性的作用常见类型：四级杆(Quadrupole)、离子阱(IonTrap)、常见类型：四级杆(Quadrupole)、离子阱(IonTrap)、飞行时间(TimeofFlight)、傅里叶变换(FTMS‐FourierTransformMassSpectrometry)3.检测器检测器作用：离子的检测并将信号传输给计算机处理信号放大(电子倍增管)质谱分类有机质谱仪气相色谱‐质谱联用仪（GC‐MS）气相色谱‐四极质谱仪，气相色谱‐飞行时间质谱仪，气相色谱‐离子阱质谱仪等。液相色谱‐质谱联用仪（LC‐MS）液相色谱‐四器极质谱仪，液相色谱‐离子阱质谱仪，液相色谱‐飞行时间质谱仪。基质辅助激光解吸行时间质谱仪傅立叶变换质谱仪基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪（MALDI‐TOFMS），傅立叶变换质谱仪（FT‐MS）无机质谱仪火花源双聚焦质谱仪火花源双聚焦质谱仪感应耦合等离子体质谱仪（ICP‐MS）二次离子质谱仪（SIMS）生物质谱生物质谱是以质谱分析技术用于精确测量生物大分子，如蛋白质，核苷酸和糖类等的分子量并提供分子结构信息;对存在于生命复杂体系中的微量或痕量小分子生物活性分子量，并提供分子结构信息;对存在于生命复杂体系中的微量或痕量小分子生物活性物质进行定性或定量分析。类型：电喷雾电离质谱，基质辅助激光解吸电离质谱，大气压电离质谱。类型：电喷雾电离质谱，基质辅助激光解吸电离质谱，大气压电离质谱。EI‐电子轰击源这是应用最普遍、发展最成熟的一种电离方法。电子轰击源对样品进行离子化的过程是这这是应用最普遍、发展最成熟的种电离方法电子轰击源对样品进行离子化的过程是这样的：首先，将样品气化后送入电离室（要使固体和液体样品气化，采用的是在较短时间内加热到一定的温度的方法）。然后，在维持较高的真空度(1.3×10-4Pa)和温度的电离室中，从阴极发射的电子束被加速到一定能量，飞向样品分子。如果电子的能量大于分子的电离能，分子将失去电子而发生电离（M+e→M++2e）；如果电子的能量大于分子的电离能，则可以打断分子中的化学键，而产生各种各样的碎片。☆优点：①易于实现，所得质谱图的再现性好。②含有较多的碎片离子信息，对于推测结构很有帮助。以后将要讲到的质谱解析就是基于EI产生的质谱图是基于EI产生的质谱图。☆缺点：当样品分子稳定性不高时，分子离子峰的强度弱，甚至没有分子离子峰。当样品不能气化或遇热分解时，则更看不见分子离子峰。CI化学电离源化学电离源的基本结构与电子轰击源相似。使用时，往离子源中送入反应气和气化的样品，由于反应气分子与样品分子相比是比较多的，所以反应气先被轰击电子电离成离子然后反应气离子和样品分子发生反应产生样品离子以甲烷反应气电离成离子，然后反应气离子和样品分子发生反应，产生样品离子。以甲烷反应气为例，部分反应为：CH4+e→CH4++2eCH++CH→CH++CHCH4+CH4→CH5+CH3CH5++M→CH4+MH+因此，质谱图上将看到样品的准分子离子峰MH+。化学电离源常用的反应气有CH4因此，质谱图上将看到样品的准分子离子峰MH。化学电离源常用的反应气有CH4、N2、He、NH3。CI谱的特点：CI谱的特点：①准分子离子峰的强度高，便于由它推算分子量。其原因有两点：一是化学电离产生的准分子离子的过剩的能量低，不易再断裂；二是化学电离产生的准分子离子是偶电子离子，较电子轰击产生的分子离子（其为奇电子离子）稳定。②碎片离子峰少，强度低。可见，CI谱和EI谱构成较好的互补关系。场致电离源采用强电场把阳极附近的样品分子的电子拉出去，形成离子。场致电离有两种技术：场电离（FI）和场解吸（FD），它们的区别在于：前者要求样品处于气态，后者则可将固体样品涂在电极上，不需气化而直接得以电离，因此，场解吸适合于难气化、可将固体样品涂在电极上，不需气化而直接得以电离，因此，场解吸适合于难气化、热不稳定的样品，如肽类、有机酸盐、糖等。场电离由于其对样品的要求，而且灵敏度又低，应用逐渐减少。☆场解吸所得质谱的特点：准分子离子峰强，碎片离子少。快速原子轰击源（FAB）它是将样品调在基质中，用高动能的重原子，如Ar、He等，对其轰击，从而导致样品的蒸发和离解，因此，FAB法也适用于难气化或热不稳定样品的分析。☆特点：快速原子轰击也是一种软电离技术，易于得到准分子离子峰。小结：电子轰击源是应用最普遍的一种电离方式，对于大部分的有机化合物，既可获得分子离子，又可获得能提供化合物结构信息的碎片离子峰。缺点是对于一法离些结构不稳定、热不稳定的化合物、或者难于气化的样品，无法得到分子离子。其它几种电离方式则弥补了这个缺点，用EI法无法得到分子离子的化合物，可以用这几种电离方法得到分子离子，因此，这几种电离方式又被称为“软电离”方式它们使大部分的分子离子不发生进步的断裂从而在质谱图中得到相对强式。它们使大部分的分子离子不发生进一步的断裂，从而在质谱图中得到相对强度较强的分子离子峰。不同的电离方式作出的同一化合物的质谱图大气压电离：API（APCI，ESI）大气压化学电离源–APCILC流体被喷射通过加热区并在大气压下气化。产生的气态分子被由电晕针产生的电子流所电离。这些离子将其电荷传输给经由化学反应产生的分子。溶液在气流作用下形成气溶胶，蒸发，电晕放电使溶剂电离，电子转移或电子捕获，使样品带电。●软电离技术，产生分子离子峰。●适合分析易挥发、热稳定、低极性和半极性的小分子化合物。●主要是分析中等极性以上的化合物可用于分析药物及代谢产物的分析等●主要是分析中等极性以上的化合物，可用于分析药物及代谢产物的分析等电喷雾质谱（ESI ）：喷雾器顶端施加一个电场给微滴提供净电荷；在高电场下，液滴表面产生高的电应力，使表面被破坏产生微滴；荷电微滴中溶剂的蒸发；微滴表面的离子“蒸发”到气相中，进入质谱仪。为了降低微滴的表面能，加热至200～250℃，可使喷雾效率提高。ESI 可以产生多电荷离子，每一个都有准确的小m/z 值。此外还可以产生多电荷母离子的子离子，这样就可以产生比单电荷离子的子离子更多的结构信息就可以产生比单电荷离子的子离子更多的结构信息。基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪（）基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪（MALDI‐TOF MS）当用一定强度的激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量样品解吸附基质样品之间发生电荷转移使得样品分子电离电离的能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即测定离子的质量电荷之比（M/Z）与离子的飞行时间成正比来检测离子离子。大气压离子化（API）使得以前质谱或液质无法检测的整类化合物的检测成为可能。但是仍有一些电喷雾和大气压化学电离无法离子化或离子化效率很差的化合物。大气压光电离（APPI）：大气压光电离源能帮助填补这个差距，它可以使质谱分析曾经无法检测的化合物。在APPI离子源中，长寿命的氪灯释放出能量在10.0和10.6ev的光量子。该能级能量足够高，可以离子化很多的有机化合物，但是将空气和常见的液相色谱流动相（如甲醇腈和水的离子化减至最低因为直接将待测物电离所以它不限于醇、乙腈和水）的离子化减至最低。因为APPI直接将待测物电离，所以它不局限于气-相，酸碱化学的原理。而且大气压光电离（APPI）源可以将其它大气压离子化技术无法电离的化合物离子化。与ESI和APCI相比，APPI拥有同样的或更好的灵敏度和线性范围；介质效应对的响小对磷酸盐有很好的耐受性易与或联对非极性APPI的影响小；APPI对磷酸盐有很好的耐受性，因而易与CE或LC联用；对非极性化合物有着很高的灵敏度；而且APPI有着较ESI小的离子抑制，尤其是ESI具有很强的离子抑制；APPI与ESI或APCI联用可扩大LC-MS同时检测的极性范围，扩大应用用。LC-APPI-MS在药物及其代谢物分析、环境分析、天然产物分析及有机合成等领域均有一定的应用，但LC-APPI-MS比较适合非极性或弱极性化合物的分析，有强紫外吸收的化合物对APPI都比较敏感比如多环芳烃共轭双键芳环等化合物我外吸收的化合物，对APPI都比较敏感。比如多环芳烃共轭双键、芳环等化合物，我想在环境中用得较多。在电喷雾，大气压化学电离和大气压光电离的正离子模式下，100pmol的苯并芘电喷雾解吸电离（DESI  ）：首次由Purdue大学Cooks于2004年提出,由于其具有样品无需前处理就可以在常压条件下从各种载物表面直接分析固相或凝固相样品。。直接实时分析质谱离子源（DART）是一种非表面接触型解析/离子化质谱分析离子源技术。其原理是在大气压条件下，中性或惰性气体（如氮气或氦气）经放电产生激发态原子，对该激发态原子进行快速加热和电场加速使其解析并瞬间离子化待测样品表面的标志性化合物进行快速加热和电场加速，使其解析并瞬间离子化待测样品表面的标志性化合物或待测化合物，进行质谱或串联质谱检测，从而实现样品的实时直接分析。表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术‐SELDI芯片