上课《菊花的组织培养》

课题1菊花的组织培养专题3植物的组织培养通过必修课的学习，我们已经了解到大多绿色开花植物都是靠种子来繁殖的。那么，有没有不用种子来培育植物的方法呢？营养繁殖扦插嫁接压条扦插嫁接压条植物组织培养是二十世纪发展起来的新技术，近三十年来由于组织培养基础理论研究的深入，发展极为迅速，发表的文献浩如烟海，几乎以植物为研究对象的各个分支学科都在广泛进行组织培养。植物组织培养具有增殖效率高、繁殖速度快的特点,可以用较短的时间和较少的空间生产出大量的试管苗。植物组织培养简介鳞托菊麦秆菊瓜叶菊植物组织培养的基本过程影响植物组织培养的因素菊花的组织培养概念：在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，在人工配制的培养基上培养，给予适宜的培养条件，诱导其脱分化产生愈伤组织、继续进行培养使其再分化形成根芽等器官，最终形成完整的植株。一、植物组织培养的基本过程离体的植物器官、组织、细胞脱分化愈伤组织再分化根芽植物体植物组织培养过程关键词：外植体、脱分化、愈伤组织、再分化外植体愈伤组织植物组织培养的原理（理论基础）——细胞全能性概念：已经分化的细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能。基础：生物体的细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质。表达条件：离体条件无菌操作适宜物质的诱导和调节（植物激素）适宜的营养物质温度、酸碱度、光照等条件的控制二、影响植物组织培养的因素材料的种类、年龄及保存时间长短等营养植物激素PH、温度、光照等条件（1）植物材料的选择烟草和胡萝卜的组织培养较为容易枸杞愈伤组织的芽诱导比较难对于同一种植物材料，材料的年龄、保存时间的长短也会影响实验结果菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝（2）MS培养基主要成分包括：A、大量元素:N、P、S、K、Ca、Mg等B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co等C、有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等D、植物激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素等讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。MS固体培养基成分及比例常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素生长素、细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈加强的趋势激素的浓度、使用顺序、使用的量及比例影响植物细胞的发育方向（3）植物激素的影响生长素类：2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）细胞分裂素类：激动素（KT）、6－苄基嘌呤（6－BA）、玉米素（ZT）赤霉素类：赤霉酸（GA3）使用顺序实验结果先使用生长素，后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但不利分化先使用细胞分裂素后使用生长素细胞既分裂、也分化同时使用分化频率高激素的使用顺序、使用的量及比例影响植物细胞的发育方向（4）pH、温度、光照pH控制在5.8左右温度控制在18－22℃每日用日光灯照射12h三、菊花的组织培养（一）制备MS固体培养基（二）外植体消毒（三）接种（四）培养（五）移栽（六）栽培（一）制备MS固体培养基MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4℃保存配制好的培养基母液来制备1、配制各种母液①无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液③用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量2、配制培养基分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml①配制培养液②调PH③培养基的分装由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素3、灭菌分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝（二）外植体消毒2、消毒①流水冲洗菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右②酒精处理用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70％的酒精中摇动2－3次，持续6－7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗③消毒液处理取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中1－2min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液（三）接种污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用70％的酒精喷雾使空气消毒，酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射20分钟1、接种室消毒2、无菌操作要求操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。3、材料的切取和接种4、接种注意事项①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为75％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种②外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3－4块，菊的茎或叶6－8块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件③插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分污染的定义指在组织培养过程中，培养容器内滋生菌斑，使培养材料不能正常生长发育，从而导致培养失败的现象。1、细菌污染：菌斑呈粘液状，界限比较明显，一般接种后1－2天即能发现。主要是大肠杆菌和链球菌污染原因2、真菌污染：菌斑呈绒毛状、絮状，界限不明显，伴有不同颜色的孢子接种后3－10天才能发现。主要是霉菌污染。污染原因正常苗污染苗1、外植体带菌2、培养基及接种器具灭菌不彻底3、接种操作时带入4、环境不清洁污染途径污染的预防措施（一）防止外植体带菌（二）保证培养基及接种器具彻底灭菌（三）操作人员严格遵守无菌操作规程（四）保证接种与培养环境清洁（一）防止外植体带菌1、选择好外植体采集时期和采集部位外植体采集以春秋为宜优先选择地上部分作为外植体阴雨天勿采，晴天下午采采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋2、室内或无菌条件下进行预培养3、外植体严格灭菌灭菌效果试验多次灭菌和交替灭菌（二）保证培养基及接种器具彻底灭菌1、分装时，注射器勿与瓶接触，培养基勿粘瓶口2、检查封口膜是否有破损看录像培养基的制备并思考制备的过程要注意些什么？3、扎瓶口要位置适当、松紧适宜4、保证灭菌时间和高压锅内温度5、接种工具用前彻底灭菌6、工作服、口罩、帽子等布质品定期进行湿热灭菌试评价下列操作正确与否（四）保证环境的清洁1、污染瓶经高压灭菌后再清洁2、接种环境定期熏蒸消毒、紫外灯照射或用臭氧灭菌和消毒3、定期对培养室消毒、防止高温植物组织培养特点①培养条件可以人为控制组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。②生长周期短，繁殖率高植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往20—30d为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。③管理方便，利于工厂化生产和自动化控制植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。思考：以下培养基出现的现象反应了什么问题？激素配比模式生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。高利于根和愈伤组织的形成生长素/细胞分裂素适中有利于根芽的分化低有利于芽的形成生长调节物质的使用甚微，一般用mg／L表示浓度。在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0.05-5mg／L，细胞分裂素0.05—10mg／L。植物组织培养过程示意图2、上面的示意图中还有什么地方不够完善的？没有进行灭菌处理，试管也没有做密封等。活性炭的应用在培养基中加入0.3%活性炭，还可降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好作用。活性炭在胚胎培养中也有一定作用，如在葡萄胚珠培养时向培养基加入0.1%的活性炭，可减少组织变褐和培养基变色，产生较少的愈伤组织。但是，活性炭具有副作用，研究表示，每毫克的活性炭能吸附l00ng左右的生长调节物质，这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中的调节物质。大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加一些琼脂。很细的活性炭也易沉淀，通常在琼脂凝固之前，要轻轻摇动培养瓶。本课题内容小结菊花组织培养基础知识实验操作植物体的组织培养影响组织培养的因素细胞分化细胞全能性组织培养过程营养激素环境条件MS固体培养基制备外植体消毒接种培养移栽栽培