2 细胞生物学技术

1第二章细胞生物学技术1第二章细胞生物学技术第一节显微镜技术第二节细胞化学技术重点：1.分辨率、沉降系数概念。2.特殊显微镜与光学显微镜的区别。3.免疫细胞化学技术。4.超离心技术。难点：特殊显微镜与光学显微镜的区别。第二章细胞生物学技术2一.光学显微镜⒈普通光学显微镜⒉特殊光学显微镜紫外光显微镜相差显微镜微分干涉显微镜荧光显微镜暗视野显微镜倒置显微镜第一节显微镜技术第二章细胞生物学技术31.普通光学显微镜目镜物镜集光器载物台光源目镜物镜集光器载物台光源4切片过程移动臂蜡或树脂包埋的样品切片用钢刀样品切片蜡带伸展在盖玻片和载玻片之间的切片移动臂蜡或树脂包埋的样品切片用钢刀样品切片蜡带伸展在盖玻片和载玻片之间的切片样品固定/染色包埋切片5μm第二章细胞生物学技术5普通光学显微镜的光路图2图像样品光线聚光器物镜22图像样品光线聚光器物镜第二章细胞生物学技术6N·sinα/20.61λD＝分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。λ：光源波长N：介质折射率（空气：1,水：1.3,香柏油：1.5）α：物镜镜口角（标本在光轴的一点对物镜镜口的张角）分辨率D值越小，分辨率越高减小λ，增大N或α（有限）λ：电子束＜γ射线＜X射线＜紫外光＜可见光线2第二章细胞生物学技术7(1).倒置显微镜(invertedmicroscope)物镜、照明系统位置颠倒。集光器与载物台之间的工作距离提高，可以放置培养皿、培养瓶等容器，直接对培养的细胞进行观察。2.特殊光学显微镜8人肝癌细胞SMMC-7721a,b,c,对照组细胞在24，72和120h的照片(×100);d,GlcNH2·HCl1000μg/ml浓度下处理24h的细胞照片(×100)9S180肉瘤小鼠肿瘤组织HE染色(×400)a,对照组;实验组对照组的肿瘤组织内，瘤细胞生长旺盛，大小不一，形态各异，呈球形、多角形、不规则形，胞核大，染色质呈深蓝色;实验组的肿瘤组织细胞有坏死现象，出现核浓缩、核破碎，伴有炎性细胞浸润。HE染色：苏木精-伊红染色第二章细胞生物学技术10(2).紫外光显微镜(ultravioletmicroscope)紫外线为光源，分辨率可提高一倍，可以看到许多在普通光学显微镜下看不到的胶体颗粒。核酸、蛋白质可吸收一定波长的紫外线，可用于定量检测。穿透力弱，不易穿透普通玻璃，故必须用以特殊材料，如石英、萤石(CaF2)、碳酸锂等制造的光学玻璃来制作显微镜透镜及载玻片等。第二章细胞生物学技术11(3).暗视野显微镜(darkfieldmicroscope)光源的光线不直接进入物镜和目镜，被标本反射或衍射的光线才能进入，因此观察的视野是黑暗的，背景上是明亮的标本。常用该方法来观察未经染色的活体或胶体粒子，可以看到明亮的被检物体的存在和运动，但它们的内部结构是看不清楚的。第二章细胞生物学技术12(4).相差显微镜(phasecontrastmicroscope)可以观察未经染色的标本或活细胞。环状光阑，环形相板。由于标本的各种结构的厚度和折射率不同，光线发生不同程度的偏斜。未偏斜光通过物镜中相差板的半透明环区，偏斜光大部分通过吸光区。3第二章细胞生物学技术13环形相板上有一环形区，制成凹槽或凸起（亦可涂上特殊物质）。对样品不同密度造成的相位差起“夸大”作用。两组光线合轴后发生干涉现象。如果为凹形相板，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗；如果为凹形相板，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗；第二章细胞生物学技术14凸形相板，则两组光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。第二章细胞生物学技术15(5).微分干涉显微镜(differentialinterferencecontrast(DIC)microscope)利用偏振光，显示结构的三维立体投影影像。类似大理石上的浮雕。DIC显微镜使细胞的细微结构立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植等生物工程的显微操作常在这种显微镜下进行。硅藻第二章细胞生物学技术16不同显微镜观察细胞的效果图普通显微镜相差显微镜DIC显微镜暗视野显微镜第二章细胞生物学技术17(6).荧光显微镜(fluorescencemicroscope)目前在光镜水平上对特异蛋白质等生物大分子定性、定位、定量的最佳工具。以紫外线为光源，用来照射标本使之发出荧光，通过物镜和目镜（石英制成）在显微镜下观察。第二章细胞生物学技术18①.自发荧光：细胞内含有某些天然物质经紫外线照射后发出荧光，如植物细胞叶绿体的叶绿素，可以发出血红色的荧光。②.诱发荧光：人为的把荧光物质加入细胞中，经紫外线照射后发出荧光，如吖啶橙(AO)染色后，细胞内RNA发出红色荧光，DNA发出绿色荧光。419人肝癌细胞SMMC-7721荧光显微镜照片(×100)a,对照组;b,实验组AO/EB双染色：AO可以透过完整细胞膜，嵌入核DNA，使之发出亮绿色荧光，EB只能透过膜受损细胞，嵌入核DNA，使之发出橘红色荧光。不仅可以看到细胞的凋亡情况，还可看到细胞的膜破损情况。第二章细胞生物学技术20肌动蛋白(红色)，微管(绿色)，DNA(蓝色)有丝分裂后期的细胞第二章细胞生物学技术21(7).激光共聚焦扫描显微镜(laserscaningconfocalmicroscope)以激光为光源对自发荧光或诱发荧光样品进行共焦、实时扫描可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察第二章细胞生物学技术22鼠成纤维细胞有丝分裂纺锤体微管蓝色为细胞核，绿色为微管第二章细胞生物学技术23二.电子显微镜人眼的分辨率一般为0.2mm，光学显微镜的分辨率为0.2μm，电子显微镜的分辨率可达0.2nm。限制显微镜分辨率的关键因素是光的波长，显微镜无论制作得如何精密都无法突破这一极限，所以一般显微镜设计的最大放大倍数为1000~1500？N·sinα/20.61λD＝第二章细胞生物学技术24各种光及电子束的波长比较名称波长(nm)可见光760-390紫外光390-13X射线13-0.05γ射线1-0.005电子束:100V0.12310,000V0.0122100,000V0.00387电子束的波长要比可见光和紫外光短得多。电压越高波长越短。V1λ5第二章细胞生物学技术25需要不需要真空样品对电子的散射和透射形成明暗反差样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化成像原理黑白图像彩色图像图像超薄切片(0.05m)石蜡切片(1~10m)切片厚度电磁聚焦机械聚焦聚焦方式电磁透镜玻璃透镜透镜电子束可见光光源电子显微镜光学显微镜1.透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope,TEM)第二章细胞生物学技术26人肝癌细胞SMMC-7721透射电镜照片.a-c,control：a,×7000;b,×4000;c,×3500;d,×4000,500μg/mlGlcNH2-Arg作用96h.第二章细胞生物学技术27(1).超薄切片技术(ultramicrotomy)28(2).负染色技术(negativestaintechnique)肌动蛋白纤维的负染电镜照片利用电子密度比标本高的重金属(如磷钨酸钠、醋酸钠)将生物标本包围起来，增强背景散射电子的能力以提高反差，在暗的背景下显示标本的形态结构，称负染色。第二章细胞生物学技术29a.将标本于-100℃的干冰中或-196℃的液氮中，超低温冰冻。b.然后用冷刀骤然将标本冲断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面结构。冰升华暴露出标本内部结构的步骤称为蚀刻(etching)。蚀刻断裂蚀刻断裂(3).冰冻蚀刻技术(freeze-etchingtechnique)第二章细胞生物学技术30c.蚀刻后，再向断裂上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下，此膜即为复膜(replica)。d.复膜显示出了标本蚀刻面的形态，可置于电镜下观察。6第二章细胞生物学技术31观察标本的表面形态。在荧光屏上显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本表面的真实结构。2.扫描电子显微镜(scanningelectronmicroscope，SEM)第二章细胞生物学技术32IBM公司瑞士苏黎世研究所的两位学者BinningG.和RohrerH.等在1981年发明。量子力学的“隧道效应”对生物、物理、化学等学科均有推动作用，可用于研究表面的原子结构和电子结构，故于1986年获得了诺贝尔物理学奖。3.扫描隧道显微镜(scanningtunnelingmicroscope，STM)第二章细胞生物学技术33加有一定电压的精密探针。探针与物质之间有电流通过。当探针沿物质表面扫描时，电流不断发生改变。将电流的改变图象化，即可显示出原子水平的样品表面凹凸形态。第二章细胞生物学技术34具有原子尺度的高分辨率。横向为0.1-0.2nm,纵向可达0.001nm。可观察三态（固态、液态和气态）物质。非破坏性测量。不接触样品，没有高能电子束轰击。第二章细胞生物学技术35用STM观察了DNA的双螺旋结构，可见DNA分子上的大沟(majorgroove)和小沟(minorgroove)，并且了解DNA的结构随染色体长度而异。第二章细胞生物学技术36细胞化学染色：利用染色剂可同细胞的某种成份发生反应而着色的原理，对某种成份进行定性和定位研究的技术。对细胞的各种成分几乎都能显示，包括无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。如Feulgen反应对DNA具有高度专一性。第二节细胞化学技术7第二章细胞生物学技术37一.免疫细胞化学技术免疫细胞化学（immunocytochemistry）：根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子相结合的小分子；抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的γ球蛋白。将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。第二章细胞生物学技术381.常用的标记方法(1).荧光标记：荧光素发出荧光。异硫氰酸荧光素(FITC)(绿)、罗丹明(红)。(2).酶标记：酶细胞化学方法。辣根过氧化物酶。(3).铁蛋白标记：含铁离子的蛋白质，双功能试剂结合，镜下可见高电子密度铁离子核心。(4).金标记：胶体金是金的水溶胶，以胶体金为显色标记物。第二章细胞生物学技术392.标记抗体与抗原结合方式(1).直接法：用标记抗体与相应抗原直接结合，操作方法简便，特异性高，但敏感性较差，此法可用于检定未知抗原。(2).间接法：先用未标记的具有特异性的第一抗体与样品中的相应抗原结合，然后再以标记的第二抗体与特异性的第一抗体结合；第二抗体是用第一抗体作为抗原注入另一动物体内诱导产生的抗体，然后再结合以标记物。通过这样的放大作用，使抗原分子上的标记物大大增多，比直接法的敏感性增高约5～10倍，应用更为广泛。第二章细胞生物学技术40二.显微分光光度技术(microspectrophotometry,MSP)显微镜技术和分光光度技术的结合，可利用显微分光光度计对一定的成分进行定位、定性，甚至定量测定。以物质分子的光吸收、荧光发射和光反射特性作为测量基础，常用的方法：显微吸收光度测量、显微荧光光度测量、显微反射光度测量及波长扫描测量。第二章细胞生物学技术41三.超离心技术离心是研究亚细胞成分和生物大分子的必要手段。离心力g=ω2·R，ω—角速度，R—旋转半径。离心力不仅与转速有关，还与旋转半径有关。第二章细胞生物学技术42沉降系数沉降系数(sedimentationcoefficient)：即每单位重力的沉降时间，单位为秒(s),通常为1～200×10-13秒范围，10-13叫做沉降系数单位，简称S，如血红蛋白的沉降系数约为4×