不同分子量蛋白质的分离—凝胶过滤层析法

不同分子量蛋白质的分离—凝胶过滤层析法一、实验目的1.了解凝胶柱层析的原理及应用。2.掌握凝胶柱层析的基本操作技术。二、实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过SephadexG－25层析后达到分离。三、试剂和器材1.材料血红蛋白溶液（Hb）：取抗凝血（肝素）2mL，离心弃去上层血浆。用0.9％NaCl洗血细胞数次（颠倒混匀，离心，弃去上清液），使离心后上清液几乎无淡黄色为止。于洗净的红细胞中加入5倍体积的蒸馏水摇匀，离心去沉淀（破碎的细胞膜等）即为Hb稀释液备用。DNP－鱼精蛋白溶液：取鱼精蛋白0.15g溶于10％NaHCO3溶液1.5mL中（此时该蛋白质溶液pH应在8.5～9.0左右）。另取二硝基氟苯0.15g，溶于微热的95％乙醇3mL中，待其充分溶解后立即倾入上述蛋白质溶液中。将此管置于沸水浴中煮沸5分钟，注意防止乙醇沸腾溢出。冷却后加2倍体积的95％乙醇，可见黄色的DNP－鱼精蛋白沉淀。离心（300r/m）5分钟，弃去上清液，沉淀用95％乙醇洗2次，所得沉淀用1mL蒸馏水溶解，即为DNP－鱼精蛋白溶液，备用。2.试剂0.9％NaCl；10％NaHCO3）；95％乙醇。pH7.0凝酸缓冲液（20mM磷酸二氢钠：20mM磷酸氢二钠＝31mL：69mL）3.器材层析柱（1′15cm）；吸管1mL(′1)；滴管；搅棒试管四、实验步骤1.凝胶溶胀取3克葡聚糖凝胶（SephadexG-25）干粉，浸泡于蒸馏水中充分溶胀（室温6小时），或者于沸水浴中煮沸1小时后冷却。充分溶胀后的凝胶以倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，如此反复洗涤2～3次，最后加入等体积pH7.0磷酸缓冲液备用。2.装柱取直径1cm，长15cm的玻璃层析柱，垂直固定在铁架台上，将层析柱下端的止水螺丝旋紧，向柱中加入约5-7cm高的磷酸缓冲液，调节流速1滴/10秒；待柱中剩下约0.5cm磷酸缓冲液时，关掉恒流泵，把溶胀好的糊状凝胶一次性倒入柱中，自然沉降20分钟，在此过程中可以看到凝胶均匀地沉降到柱的底部并不断地上升。20分钟后，用镊子小心在胶面上放置圆片滤纸，用滴管补加缓冲液（注意随时添加缓冲液，防止柱床干裂）。同时开启恒流泵，控制一定的流速，使柱中的凝胶一直处在溶液中。若分次装入凝胶，需用玻璃棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面分层。装柱长度至少10cm。3.平衡用磷酸缓冲液冲洗洗脱，平衡20分钟。注意在任何时候不要使液面低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动。4.样品制备取DNP－鱼精蛋白溶液3滴和Hb溶液1滴混合，即为上柱样品。5.上样待层析柱上缓冲液几乎全部进入凝胶时，关掉恒流泵，用滴管将上述样品沿柱内壁小心加到床表面，注意尽量不使平整的床表面搅动，然后打开恒流泵，让样品进入柱床。待其将进入柱床时，关掉恒流泵，用滴管小心加入磷酸缓冲液至柱顶。6.洗脱旋紧柱顶，将进液管接入洗脱液瓶中，用缓冲液进行洗脱，控制缓冲液在约每10秒一滴的流速，观察并记录Hb和DNP－鱼精蛋白在层析柱中的位置，并解释之。待所有有色条带完全流出柱子后，继续洗柱5min。停止恒流泵，卸下柱子，旋下柱顶螺旋，将凝胶倒回小烧杯中并取出滤纸片。7.注意事项（1）根据层析柱的容积和所选用的凝胶溶胀后柱床容积，计算所需凝胶干粉的重量，用洗脱缓冲液使其充分溶胀。（2）层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据试剂需要选择。一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径太小时，会发生“管壁效应”，即柱管中心部分的组份移动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。（3）各接头不漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。（4）装柱要均匀，不要过松也不要过紧，最好也在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。但也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。（5）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。五、思考题1.凝胶过滤法除了可以进行不同分子量蛋白质的分离，还可以进行未知蛋白质分子量的测定，简述后者的实验原理。2.影响凝胶过滤层析实验结果的因素有哪些？