不同提取方法对虎杖中蒽醌类成分及其抗氧化活性影响的研究

不同提取方法对虎杖中蒽醌类成分及其抗氧化活性影响的研究来源：心脏彩超【摘要】目的研究不同提取方法对虎杖蒽醌类成分及其抗氧化作用的影响。方法采用回流、索氏、微波及超声四种提取方法，测定四种提取液中的游离蒽醌和总蒽醌的含量；采用DPPH，FRAP两种方法测定其抗氧化活性，并分析蒽醌类成分和抗氧化活性之间的关系。结果在对游离蒽醌的测定中以索氏法为最高（0.53%），其次为超声（0.45%），各种方法之间相比差异显著（P＜0.05）；在对总蒽醌的测定中，结果如下：索氏（1.16%）＞超声（1.15%）＞微波（1.04%）＞回流（0.80%）；抗氧化活性测定发现，以回流液的抗氧化能力最强，其次是微波，二者与超声和索氏的相比有显著性差异（P＜0.05）；相关性分析发现，蒽醌的含量与抗氧化活性呈显著的负相关(P＜0.01)。结论不同提取方法影响虎杖蒽醌类成分和抗氧化活性，蒽醌类成分和抗氧化活性之间具有负相关的关系。【关键词】提取方法；虎杖；蒽醌；分光光度法；抗氧化虎杖系蓼科蓼属植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.etZucc.的根茎和根，具有抗菌、抗病毒等广泛的治疗作用［1］。其主要有效成分为蒽醌类、二苯乙烯类、黄酮类等。随着近年来对其药理作用的深入研究，虎杖的抗氧化作用也日益为人们所重视［2，3］。蒽醌类成分作为虎杖中主要有效成分，在治疗疾病过程中起着较为重要的作用，本实验主要研究了不同提取方法对虎杖中蒽醌类成分及其抗氧化作用的影响，并分析蒽醌类成分和抗氧化活性之间的关系。1仪器与材料1.1仪器JY92-Ⅱ超声波细胞破碎仪，宁波新芝科器所；微波炉，广东美的微波炉制造有限公司；UV-2800紫外分光光度计，尤尼柯（上海）仪器厂；酸度计，意大利哈钠；微量移液器，eppendorf；Sartorius电子天平（型号1702，称量范围200g，感量0.1mg）,德国Sartorius；FZ102微型植物试样粉碎机，北京市永光明医疗仪器厂；回流提取装置；索氏提取装置。1.2材料大黄素对照品（中国药品生物制品检定所，批号110756－200110，供含量测定用，经归一化法标定98.0%）；二苯代苦味酰基自由基(1，1-pheny-2-picrylhydrazyl，DPPH)Sigma；TPTZ（2，4，6-tripyridyl-s-trizine）Sigma；虎杖药材（购自河南仟僖堂医药公司，经河南中医学院曹继华教授鉴定为正品）；其余试剂均为国产分析纯。2方法2.1对照品溶液的制备精密称取大黄素对照品(105℃干燥至恒重)4.1mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度。精密吸取上述溶液1ml，置10ml量瓶中，加0.5%醋酸镁-甲醇溶液至刻度，作为对照品溶液。2.2样品的前处理将虎杖经过干燥，采用微型植物试样粉碎机进行粉碎，过60目筛，粉末经恒温（60℃)干燥24h后，放干燥器中，备用。2.3供试品溶液的制备2.3.1回流提取液的制备精密称取2.2项下样品约0.5g，置50ml的圆底烧瓶中，加70%的乙醇回流提取3次，提取时间分别为1.5，1，1h，乙醇用量分别为20，15，15ml，合并3次回流提取液，定容至100ml的容量瓶中，备用。2.3.2索氏提取液的制备精密称取2.2项下样品约0.5g，采用70%乙醇进行索氏提取，提取至无颜色为止（约6h），提取液定容至100ml的容量瓶中，备用。2.3.3超声提取液的制备精密称取2.2项下样品约0.5g，置50ml的三角瓶中，70%的乙醇超声提取3次，3min/次（辐射时间为10s/次，间隙10s，工作18次），乙醇用量分别为20，15，15ml。合并3次的超声提取液，定容置100ml的容量瓶中，备用。2.3.4微波提取液的制备精密称取2.2项下样品约0.5g，置50ml的三角瓶中，70%的乙醇微波提取，提取3次，1min/次，（工作时间为10s/次，间隙60s，工作6次），乙醇用量分别为20，15，15ml。合并3次的微波提取液，定容置100ml的容量瓶中备用。2.4蒽醌百分含量的测定2.4.1游离蒽醌百分含量的测定分别精密吸取2.3项下各供试品溶液10ml，水浴上蒸干，再加20ml蒸馏水溶解，加氯仿萃取3次（20，15，15ml），合并3次氯仿萃取液，定容至50ml的容量瓶中，精密吸取15ml，水浴上蒸去氯仿，残渣用0.5%醋酸镁-甲醇溶液溶解，定容至10ml的容量瓶中，摇匀，放置20min。以0.5%醋酸镁-甲醇溶液为空白，测定其在510nm处吸光度值。2.4.2总蒽醌百分含量的测定分别精密吸取2.3项下各供试品溶液10ml，水浴上蒸干，加2.5mol/L的硫酸20ml水解2h，稍冷，加氯仿20ml继续水解2h。放置至室温后，转移至分液漏斗内，并用氯仿洗涤烧瓶，并入分液漏斗中，分取氯仿层置100ml的容量瓶中，酸水层继续用氯仿萃取3次（20，15，15ml），并入上述100ml的容量瓶中，精密吸取30ml，蒸馏水洗至中性，置水浴上挥干氯仿层，残渣用0.5%醋酸镁-甲醇溶液溶解，定容至10ml的容量瓶中，摇匀，放置20min。以0.5%醋酸镁-甲醇溶液为空白，测定其在510nm处吸光度值。2.5抗氧化活性的测定2.5.1总抗氧化能力的测定［5］取2.3项下各供试品溶液，适当稀释后移液器取100μl，加入FRAP工作液（300mmol/L醋酸盐缓冲液，10mmol/LTPTZ，20mmol/LFeCL3）3ml，混匀反应20min，于593nm处读取吸收度，以FeSO4为标准物质绘制标准曲线，样品的抗氧化能力以FRAP值表示：1FRAP单位=1mmol/LFeSO4，即样品的抗氧化能力相当于FeSO4的mmol/L数。2.5.2清除自由基能力的测定［6］取2.3项下各供试品溶液，适当稀释后移液器取100μl，加入2ml0.2mmol/LDPPH的乙醇溶液，混合均匀，黑暗下室温避光反应20min，在517nm处测定吸光度，同时以2mlDPPH+100μl缓冲溶液混合后的吸光度为空白组，计算清除率/%=［1－药品组A517/空白组A517］×100%。2.6系统适用性实验2.6.1测定波长的选择取大黄素对照品适量，用0.5%醋酸镁-甲醇溶液溶解，在360～600nm波长间进行扫描，发现大黄素在510nm处有最大吸收峰，故选510nm作为检测波长。见图1。2.6.2线性关系考察精密称取大黄素对照品(105℃干燥至恒重)4.1mg，置50ml量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度。精密吸取0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.6，2.0ml，分别置于10ml量瓶中，加0.5%醋酸镁-甲醇溶液至刻度，放置20min。以0.5%醋酸镁-甲醇溶液为空白，分别测定溶液在510nm处的吸光度。以吸光度对浓度进行线性回归，得到回归方程：Y=0.0443X+0.0137，线性范围为3.28～16.4μg/ml，r=0.999。2.6.3精密度实验取2.1项对照品溶液，重复测定5次，测得的吸光值RSD为1.3%（n=5）。2.6.4重现性实验取虎杖5份，按2.3.3项下的供试品溶液的制备方法制备，并依2.4项下的方法分别测定游离蒽醌和总蒽醌的吸光值，测得的吸光值RSD分别为2.3%，2.8%（n=5）。2.6.5稳定性实验精密称取大黄素对照品和虎杖适量，按2.1和2.3.3项下的方法制备供试品溶液，并按2.4项下的方法测定，每间隔20min测定吸光度，共测6次，结果吸光值的RSD分别为0.6%，1.2%，表明大黄素和虎杖样品的吸收度值在2h内基本稳定。2.6.6加样回收率实验精密称取上述已知含量的虎杖粉末约0.1g，加入82μg/ml大黄素甲醇溶液1ml，按2.3.3项下方法制备供试品溶液，测定回收率，结果平均回收率为97.2%，RSD=2.3%（n=5）。2.7数据统计数据采用SPSS11.0软件进行显著性分析，多重比较采用Duncan检验，以提取方法为控制因素进行相关分析，Excel作图。3结果3.1不同提取方法对虎杖中游离蒽醌含量的影响4种提取方法对虎杖中游离蒽醌的提取含量见图2，从图2中可以看出以索氏提取法为最高，百分含量为0.53%，其次为超声提取，含量为0.45%，微波法为0.25%，回流法为0.12%，并且各种提取方法之间相比差异显著（P＜0.05）。3.2不同提取方法对虎杖中总蒽醌含量的影响不同提取方法对虎杖中总蒽醌含量的影响见图3，在图3中可以看出，对总蒽醌的测定中，索氏提取值为最高，百分含量达到1.16%，超声提取仅次于索氏提取，含量为1.15%，两者相比没有显著性差异（P＞0.05）。回流提取法测得总蒽醌百分含量为0.80%，微波提取法为1.04%，这两种方法与索氏和超声相比差异显著（P＜0.05）。3.3不同提取方法对虎杖抗氧化能力的影响不同提取方法对虎杖抗氧化能力的影响见图4。由图4可知，以回流提取液的抗氧化能力最强，FRAP值为214，其次是微波提取液，FRAP值为195，这两种提取液的抗氧化能力相比差异不显著（P＞0.05），但与超声和索氏的相比有显著性差异（P＜0.05），超声提取液的FRAP值为104，索氏提取液的为90，超声与索氏提取液的抗氧化能力相比无显著性差异（P＞0.05）。3.4不同提取方法对虎杖清除自由基能力的影响不同提取方法对虎杖清除自由基能力的影响。见图5，由图5可以看出以回流提取液的清除自由基能力最强，自由基清除率达到63%，其次是微波提取液，达到57%，这两种提取液的抗氧化能力相比差异不显著（P＞0.05），超声与索氏提取液的清除自由基能力分别为32%，27%，二者相比无显著性差异（P＞0.05），回流和微波提取液的抗氧化能力与超声和索氏的提取液相比有显著性差异（P＜0.05）。3.5蒽醌含量与抗氧化活性间的相关关系由表1可以看出，经相关性分析后游离蒽醌的含量与总蒽醌的含量有很强的相关性，相关系数达到0.9323（P＜0.01），游离蒽醌与FRAP值和自由基清除率也具有很强的负相关，相关系数分别达到-0.9837（P＜0.001），-0.9909（P＜0.001），总蒽醌受到游离蒽醌的影响也与FRAP值和自由基清除率具有很强的负相关，相关系数分别为-0.8902（P＜0.01），-0.8950（P＜0.01）。表1游离、总蒽醌与抗氧化活性的相关关系（略）4讨论4.1对蒽醌类成分的显色，常用的显色剂为NaOH，KOH，5%NaOH-2%NH4OH及醋酸镁甲醇溶液。由于前几种显色反应所呈颜色对光及氧不稳定，而且其所呈颜色最大吸收由500～518nm不等，影响吸收度的测定［4］。笔者曾采用NaOH作显色剂，但不及醋酸镁-甲醇显色稳定，且醋酸镁反应所呈颜色为红色，杂质干扰少。而且其所呈颜色最大吸收在510nm左右，且显色20min以后吸收度趋于平稳，因此测定应在20min～2h内完成。4.2对总蒽醌成分的测定，酸水解以后，加入氯仿进行两相水解较单纯的酸水解以后氯仿萃取效率较高，因此本实验采用首先酸水解2h，加入氯仿继续水解2h的方法，总蒽醌的提取效率增加8%左右。另外，萃取后的氯仿层必须用蒸馏水水洗至中性，否则，会大大影响加入醋酸镁-甲醇以后的吸收度，从而影响试验结果。4.3有效成分的溶出通过润湿－渗透－解吸－溶解－扩散的途径，而提取过程中的外力作用造成表面及细胞组织的破坏，可提高组分的溶出程度，并使溶出过程加速。本实验采用超声细胞破碎提取器进行提取，和一般的超声清洗器相比，功率较高，细胞破碎程度较高，而且，本方法是将超声探头深入到提取液内，因此提取时间短，效率高，但与索氏提取相比，因提取次数较少，残渣中可能残留少量有效成分，因此结果偏低，笔者也曾采用提取4次，5次等方法，结果增加3.0%，5.1%，但考虑提取药物一般采用提取3次的方法，另外为和回流、微波等方法平行，因此仍然使用提取3次的提取液。4.4从整个实验结果来看，索氏提取对游离蒽醌和总蒽醌，提取效率最高，但耗时长达6h，超声处理仅需