2提质粒_XXXX年分子生物学实验

实验一质粒DNA的提取及鉴定背景理论知识Section1•掌握质粒信息和用途，学会自己看质粒图谱•掌握快速提取小量质粒DNA的方法•了解质粒DNA提取的基本原理•掌握琼脂糖凝胶电泳的方法1.1.1实验目的1.1.2载体定义：基因工程中携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。类型：大肠杆菌中的质粒、噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体及动、植物病毒载体等。载体的基本条件复制子：一段具有特殊结构的DNA序列，使与之结合的外源基因复制。可检测的遗传表型：如抗药性、显色表型反应。限制性内切酶的单一识别位点：便于外源基因的插入。适合的拷贝数：较高的拷贝数不仅有利于载体的制备；使细胞中克隆基因的剂量增加。1.1.2载体质粒载体是染色体外小型的双链环状的DNA，常用载体之一自我复制具有合适的限制酶切位点筛选标记可编码某些遗传性状如抗药性、耐受重金属、产生细菌素等，被质粒转化的细菌也获得了额外的特性高拷贝数小分子量1-200Kb高稳定性1.1.2载体克隆载体表达载体原核真核穿梭载体pGEM-T,pENTRpET28a(+),pGEX,pMALpcDNA3.0,pEGFP-N3,pRK质粒载体的分类根据用途分类1.1.2载体质粒（原核载体）1.1.2载体1.1.2载体质粒（真核载体）1.1.2载体1.1.3质粒提取一般步骤1.细菌培养物的生长2.细菌的收获和裂解3.质粒DNA的纯化质粒提取的常用方法•碱解法、煮沸法（cDNA、pDNA变性、复性不同）•苯酚抽提法（酸性、低离子强度时超螺旋在水相分布）•CsCl法（EB插入造成DNA浮力密度不同）•SDS裂解法（高盐浓度下大分子沉淀，质粒在上清）•玻璃纤维膜法(试剂盒)1.1.3质粒提取碱裂解法提取质粒DNA[目的要求]通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法和技术。1.1.3质粒提取[实验原理]根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。•在pH12.0-12.5，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，质粒DNA的氢键断裂，但两条互补链仍紧密结合。•当加入pH4.8的KAc高盐缓冲液中和pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性慢，缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与RNA、蛋白质-SDS复合物等一起絮状沉淀下来而被除去。碱裂解法提取质粒DNA1.1.3质粒提取实验操作Section21.2.1实验材料•含质粒载体（pET28a）和含目的基因质粒（pEGFP-N3）的大肠杆菌DH5a•溶液I50mmol/L葡萄糖5mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris.HCl）（pH8.0）10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）•溶液II0.4mol/LNaOH，2%SDS（用前等体积混合）•溶液III5mmol/L乙酸钾，冰乙酸，H2O•苯酚：氯仿（25：24）•氯仿：异戊醇(24：1)•无水乙醇，•70%乙醇(-20C保存)•TE缓冲液:10mmol/LTris.HCl,1mmol/LEDTA(pH8.0)•胰RNA酶1.2.1实验材料1.2.2实验程序任务分配：A1和B1提取pET28a质粒A2和B2提取pEGFP-N3质粒1、细菌培养和收集①将3ml含Kan的LB液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。（已完成）②取2.5mL培养物倒入微量离心管（EP管）中,10000rpm离心1min，吸去培养液。2、细菌裂解及质粒的提取①将细胞沉淀悬浮于100ul溶液I中,充分震荡混匀。②加200ul溶液II(新鲜配制),盖紧管盖,轻轻混匀内容物,将离心管放冰上5min。③加150ul溶液III(冰上预冷),盖紧管口,轻轻颠倒数次使混匀。冰上放置5min。④12000rpm离心10min,将上清转至另一EP管（作好标记）中。1.2.2实验程序①向上清中加入等体积（450ul）酚:氯仿(1:1)（注意下层是有机相）,反复混匀。②12000rpm,离心2分钟,将上清小心地转移到另一离心管（标记！）中③加入等体积（450ul）氯仿:异戊醇(24:1),反复混匀。④12000rpm,离心2分钟，取上清液于新的EP管中。3、质粒的纯化1.2.2实验程序4、质粒的浓缩①加入2倍体积（900ul）无水乙醇,混匀后,室温放置10min。②12000rpm离心5分钟，倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。③用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀,振荡并离心,12000rpm离心2分钟，倒去上清液,空气中干燥5－10min。1.2.2实验程序5、质粒的溶解和保存加20ulTE缓冲液,其中含有100ug/ml的胰RNA酶,使DNA完全溶解。-20℃保存。1.2.2实验程序样品保存1A11A21B11B22A12A22B12B23A13A23B13B24567891011121314151.2.2实验程序6、质粒DNA的电泳检测（1）琼脂糖凝胶的制备①每4人制备一块琼脂糖凝胶（6个泳道）②0.2克琼脂糖+20毫升TAE缓冲液，电炉融胶（充分溶解），稍微冷却加2µlgoldviewna显示液，倒在电泳胶槽中，使胶凝固(20min)。1.2.2实验程序（2）琼脂糖凝胶电泳①每人1个样品，pET28a或pEGFP-N3。②取3µl质粒DNA+1.0µl点样缓冲液，在parafilm膜上混匀后全部点至琼脂糖凝胶孔（记住自己点样位置）。③接通电泳仪和电泳槽的电源(注意正负极)（-→+）④恒压150V,电泳10-20分钟⑤紫外灯下观察并记录结果(对面实验室拍照片)⑥分析结果。1.2.2实验程序负极－正极＋1A11A21B11B22A12A22B12B2Marker1.2.2实验程序实验关键点溶液I加入后充分悬浮溶液II一次性加入后轻柔地颠倒混匀溶液III加入后轻柔地颠倒混匀酚抽提后小心吸取上清无水乙醇和70%乙醇不要弄混微量加样器的正确使用移液器（排气式和排液式）1．选择一支量程合适的移液器2．设置移液量3．装枪头4．检验移液量5．吸取一定体积的液体6．目测吸入枪头的液体体积是否合理7．释放液体8．退下枪头实验要求：•每人提取质粒2份（pET28a和pEGFP-N3各一份）•溶液每大组一套•枪每2人一套•Tips2人一套（3盒）思考题①分子生物学实验常用的载体有哪些？它们的特点是什么？②分离基因组DNA和质粒DNA有哪些不同之处？③核酸分离过程中，酚、氯仿、异戊醇的作用是什么？④在TE缓冲液中为什么要加入EDTA？⑤纯化的核酸如有酚和蛋白质的污染的话，对它的后期操作有何影响？⑥有哪些因素影响核酸的沉淀？下次实验质粒DNA的酶切鉴定及电泳检测开始工作吧！LET’SBEGINNOW！