与肌肉代谢和结构有关的不同肉质表型识别基因的猪种间的肌肉转录组比较

与肌肉代谢和结构有关的不同肉质表型识别基因的猪种间的肌肉转录组比较摘要背景：肉的品质取决于发生在肌肉组织中的生理过程，这可能会涉及到一系列与肌肉结构和新陈代谢特性有关的基因。了解在屠宰过程中肉类表型之下的生物现象对揭示肉品质的变化是必要的。因而，要对肌肉转录组进行分析，比较两个高对比度猪品种（长白（LW）和巴斯克（B））的基因表达图谱，可以知道不同的饲养环境会影响到肉的品质。LW是养猪业中占有优势的品种，这不利于肉类质量属性的标准的设定。B是以低瘦肉、高脂肪含量、高肉质为特性的本地品种，该品种从遗传学的角度与欧洲其他的猪品种相距甚远。方法论/主要发现：进行转录组分析使用一个自定义的15k微阵列，突出了不同品种之间表达有差异的1233个基因（使用α=0.05多重检测），其中的635个在B品种中高度表达，598个在LW品种中高度表达。在不同的饲养环境中基因的表达没有不同。另外，12个差异表达基因的表达水平被实时RT-PCR验证微阵列数据量化。集群功能注释强调了与转录品种差异有关的四个主要集群：代谢过程、骨骼肌结构和组织、细胞外基质、溶酶体，蛋白质水解。从而，突显出与肌肉生理和肉类品质变化有关的许多基因。结论/意义：总之，这些结果将有助于更好地了解肌肉生理和肉品质变化潜在的分子和生物过程。另外，本研究是识别猪肉品质的分子标记和调控手段后续发展的第一步。引言因市场对瘦肉的需求日益增长,故引导猪的繁殖计划向获得现代肉用型猪发展。有目的通过增加日增重和胴体瘦肉率来提高猪生产性能的同时也提高了猪的生长速率、饲料转化率、瘦肉含量和腰眼面积的增长，减少了背膘厚和胴体脂肪含量。然而，消费者对猪肉的评价中扮演重要角色的一些肉品质性状，比如系水力、颜色、PH、肌内脂肪含量和嫩度也受到影响。影响肉品质的因素是复杂的，它依赖于猪的基因型、环境条件、宰前处理、屠宰过程。此外，肉品质的变化取决于发生在肌肉中的生理过程，这个过程涉及到许多与肌肉结构和代谢特点有关的基因。弄清楚肌肉品质性状有不同的选择和非选择品种间的转录组表达谱差异，可能有助于理解肉品质变化的生理过程。为了这个目的，设计该实验研究在胴体脂肪含量和肉品质方面有鲜明对照的两品种(LW和B)猪的背最长肌的基因表达谱。LW在现代养猪业中是最有优势的品种，它以高瘦肉率、低脂肪含量和高日增重为特点，但有标准的肉品质。相比之下，B是本地的品种，以低瘦肉率和高脂肪含量、高肉品质为特点,它从遗传学角度来说与其他欧洲的猪品种相去甚远。此外，尽管越来越多的出版物关注基因表达与猪肉质量的关系，目前的转录组分析是第一个从事对高肉质量的B品种的研究。我们研究的目的是探讨LW和B两种猪与肌肉性状和肉品质方面有关系的LM转录组谱，从而阐明文献报道中导致这两种猪产生巨大表现差异的生物现象和提高我们对肉品质的综合判断。这两种猪要么在可选择的饲养条件下饲养（A，室内圈养和室外散养；n=10），要么在传统饲养条件下(C，全漏缝地板，n=10)，研究表明不同的饲养方式已经影响了一些肌肉和肉品质的性状。为了获得关于基因表达图谱的精确信息，转录组分析时使用了一种新的、特定的猪肌肉微阵列，即15KGenmascqchip，其中85％的探针与一个特定的注释序列和9169个特定基因相关。对基因本体论生化过程和功能注释集群的功能分析正在进行，来突出生物网络和肌肉生理、肉类品质相关基因的密切关系。结果增重、机体组成和背最长肌特征如表１所示，B和LW两个猪品种在增重、机体成分、最长肌组成、生物物理特征和肉的感官性状上表现出很大的不同。由于B的日增重低，要达到相同的体重，B比LW需要更长的时间（85天），同时表现出更高的背膘厚（75％）和更低的腰肌比例（230％）。在LM组成上，B的含量水比LW稍高，而总的蛋白质含量基本相近。LM的胶原蛋白含量和糖酵解潜力比B高，但肌内脂肪含量（251％）比B低。LW也表现出高的滴水损失和剪切力，低嫩度、香味和多汁性。饲养环境对增重、机体成分、LM组成和生物物理特征没有显著影响。A饲养环境中肉的嫩度比C饲养环境要低（4.0vs.4.4,P=0.018），但多汁性和香味并没有什么不同。转录分析用定制的15K骨骼肌猪微阵列（Genmascqchip）进行B与LW肌肉转录组的比较，该微阵列可以通过基因表达综合平台公开利用，编号为GPL11016。简单说，这种新的猪的骨骼肌微阵列能被很好的注释（超过70%），从而可以研究与8622个人类EntrezGeneID相对应的9169个独特的基因。基于网络的基因集分析工具包主要用于针对生化过程的基因本体论分类。GO-slim（代表高水平基因本体论）用于聚焦最重要的过程。如图1所示，13个生化过程十分突出。其中代谢过程是最重要的一类（涵盖50%的基因），而增重过程仅涵盖不到5%的基因，仍有20%左右的基因没有归类。通过对饲养在两个不同的饲养环境中（C,n=10每种和A,n=10每种）的两个品种（B,n=20和LW,n=20）进行转录分析来比较它们肌肉表达谱的差异。LW的基因表达并没有因为饲养环境的变化而发生改变，因为在A与C猪中没有发现差异表达探针。相比之下，我们观察到一个对基因表达有影响的优良品种，有12%的探针在B与LW品种间表达是有差异的（P≤0.05）。基因表达在品种间显示出显著的不同，这些品种可以根据叠化值分为两列。叠化值可以通过当基因在B品种高度表达时B与LW样品表达比率来表示或是通过当基因在LW品种高度表达时LW与B样品表达比率来表示。差异表达基因与1223个独特的注释基因有关，其中635个基因在B品种高度表达（表S1），而598个基因在LW品种高度表达（表S2）。详细的基因名称、描述、识别、叠化值和适当显著水平的BH值，在表S1和表S2中有具体说明。如果有冗余（每个基因有超过一个探针），则叠化值总是与和微阵列数据高度一致的探针集相似。显著差异表达（FC2）和丰富的信息性（至少有一个相关的GOBPterm）都在表2中说明，表2中的基因是在B品种中高度表达的（2FC=2.6），表3中的基因是在LW品种中高度表达的（2FC=5）。B品种中在最长肌上高度表达的15个基因中，有四个参与了脂质代谢：磷脂酶A成员A1(PLA1A)、蛋白质脂肪酸转移酵素亚族β(FNTB)、鞘磷脂磷酸二酯酶酸类似物3A(SMPDL3A)、激素敏感脂肪酶(LIPE)。这四个基因参与转录或翻译：锌指蛋白410、锌指蛋白24、细胞质聚腺苷酸化元素相关蛋白2、角蛋白和Ⅱ型细胞骨架7。还有三个基因参与离子转运或离子体内平衡：线粒体的钠氢交换、钙离子激活通道钾离子交换、液泡融合蛋白MON1同系物A。LW品种中在最长肌上高度表达的26个基因中，有6个基因参与了转录或RNA的生成：锌指蛋白7、RNA聚合酶相关蛋白RTF1、干扰素调节因子8、LSM3同系物、去乙酰化酶3和锚蛋白重复域1。5个基因参与防御、免疫系统或应激过程：白介素10受体亚族β、谷胱甘肽过氧化物酶8、天冬酰胺合成酶、干扰素调节因子8和锚蛋白重复域1。有4个基因参与了氧化还原过程：aldoketo还原酶1族成员B1、谷胱甘肽过氧化物酶8、metaxin3、乙醛酸盐还原酶/羟基丙酮酸还原酶。最后，有3个基因参与了葡萄糖的代谢过程：葡萄糖磷酸变位酶1、溶质载体5族成员4、乙醛酸盐还原酶/羟基丙酮酸还原酶。通过定量RT-PCR验证基因芯片分析在差异表达基因中，选出12个通过实时定量PCR来验证微阵列差异表达结果。其中6个基因在LW中高度表达（ADAMTS8,SPARC,GLOD4,ANKRD1,HHATL和IGF1），6个基因在B中高度表达（LIPE,ZNF24,FOS,FABP3,PPARD和FHL3），在微阵列分析中FC的扩展值在1.2—4.3之间，RT－PCR分析也是这样。结果见图２。用RT－PCR的方法，所有12个基因在两品种间表达有差异，使用两种方法，如微阵列和RT－PCR，每一个基因的FC值是相似的。品种间差异表达的功能分析这两列基因，在B中高度表达的635个基因和在LW中高度表达的598个基因，使用了注释数据库进行基因本体BP富集分析，该数据库包括可视化和集成发现生物信息资源。重要结果（显著性水平P=0.05）见于表4。与脂质代谢和运输、碳水化合物代谢和运输有关的基因本体BP，富集在B中高度表达的基因列表。而生物吸附、蛋白质聚合趋化和细胞骨架组织有关的基因本体BP，富集在LW中高度表达的基因列表。为了减少冗余并研究一个网络格式中的功能相关基因，使用DAVID工具完成了功能注释集群。为在B（表5）中和LW（表6）中高度表达的基因列表，我们使用三个基因本体论术语、BP、细胞元件（CC）、分子函数（MF）、BIOCARTA和关于基因、基因组的KEGG[20]等方法建立了一个功能相关集群的生物模块。根据黄等人的研究，一个相当于P=0.05的非对数标尺的富集数据1.3，已经用于集群意义的阈值来使用。在B中高度表达的基因列表中，发现有6个改进群有超过1.3的改进数据。根据功能把基因分为3个群：细胞骨架基因（集群1-B）、液泡和溶酶体（集群2-B）、葡萄糖代谢过程（集群4-B）。其他三个集群（集群3-B、5-B、6-B）与转录过程有关。在LW中高度表达的基因列表中，确定了8个集群，它们与细胞外胶原蛋白（集群1-LW,2-LW和5-LW）、多糖绑定（集群3-LW）、细胞运动（集群4-LW）、收缩纤维和肌动蛋白聚合（集群6-LWand7-LW）和趋药性（集群8-LW）有关。讨论在遗传背景上，B品种是欧洲七个国家的11个品种中以“独特”为特点的本地品种。尽管有越来越多的出版物关注基因表达与猪肉品质的关系，本研究是第一个对非选和具有高肉质猪品种的转录组分析。我们的目标是阐明可以揭示文献中报道的B与LW品种肌肉表型差异的生物现象。整个骨骼肌组织的转录图谱显示了一个挑战，即因为基因表达的变化可能会反映出存在于该组织中的各种细胞的mRNA组成的变化。然而，即使我们不能把表达的改变归因于一个特定的细胞类型，我们可以假设肌纤维是主要的一种细胞类型，假设在组织上品种的比较是作为一个整体进行的。在转录组分析之后，LW与B之间的12个差异表达的基因已经通过定量PCR分析完全确定下来了，因此也能证明新的GenmascqChip是一个研究猪的基因表达的功能强大的工具，从而可以更好地理解肌肉生理。从遗传背景方面比较骨骼肌基因表达的差异，仅有这些研究数据是远远不够的。本研究中两品种间差异表达的基因数目与文献记载的数量相同。在B与LW品种中基因表达的高度差异是均衡的，各自有635和598个基因高度表达，这表现出在生长性能、骨骼肌特点和肉品质性状上的优良品种差异。特别是，与LW相比B具有较低的瘦肉率和明显的高脂肪含量，这和之前B与LW在增重、胴体、肌肉特点和脂肪组织代谢上的比较一致。为了在相同的时间和体重宰杀两种猪，因为B品种生长速度比较慢，所以B品种提前两个月开始实验，在屠宰时B品种猪比LW品种猪大三个月。此外，为达到给定活重两品种饲喂相同数量的饲料，然而LW的潜在增长速率和食欲比B要高。因此，品种、年龄和饲养的影响是复杂的。相反，LM基因表达图谱在A和C饲养环境是没有区别的。因此，饲养环境不会影响LM组成、生物物理特点和肉的品质，但会影响肉的嫩度。这与之前的对比研究不同，从而可以确认动物对不同饲养环境的反映取决于基因型、环境条件等。此外，饲养环境间嫩度的差异比品种间的要低。这也支持这个理论，即一般基因型对肌肉特性的影响要比饲养环境大，特别是对高对比性品种来说。然而，我们不能排除屠宰条件可能会掩饰宰前饲养环境的影响。LW和B之间的差异表达基因的功能分析突出了与品种差异有关的四个主要相关生物网络：１代谢过程，２细胞骨架和收缩纤维，３细胞外基质，４液泡、溶酶体和蛋白质水解。我们将会就肌肉生理和肉类品质方面对每一类别中的一些基因进行讨论。叠化值可以用当基因在巴斯克品种高度表达时，巴斯克（B，n=20）和长白（LW,n=20）样本的表达率来表示；也可以用当基因在LW品种高度表达