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1第六章实验方法的选择与检测系统的评价验证2教学目的和要求：1、掌握实验方法的分级；实验方法选择的目的、原则；检测系统性能评价的内容；方法评价实验尤其是回收实验和干扰实验的原理和操作。2、熟悉实验方法选择的步骤；试剂盒的使用。3、了解试剂盒的类型和选购3第一节实验方法的选择选择准确可靠的实验方法为临床提供准确可靠的信息临床生化检验分析保证4一、实验方法的分级分级依据：国际临床化学协会（IFCC）根据分析方法的准确性与精密度的不同。常规方法参考方法决定性方法分为三级：5（一）常规方法（routinemethod）定义：应具有足够的精密度、准确度和特异度，有适当的分析范围，经济实用，其性能指标符合临床或其它目的的需要。主要方法：溴甲酚绿法、双缩脲法、J-G法等。应用：临床常规检验使用，常规方法在作出评定以后，经有关学术组织认可，可以作为推荐方法（recommendedmethod）。偏差已知方法偏离未知方法6（二）参考方法referencemethod定义：是指准确度与精密度已经被充分证实，且经公认的权威机构（国家主管部门、相关学术团体和国际性组织等）颁布的方法。这类方法干扰因素少，系统误差很小，有适当的灵敏度、特异度、较宽的分析范围并且线性良好，重复测定中的随机误差可以忽略不计。主要方法：原子吸收分光光度法、火焰光度法、免疫化学法，离子交换层析法等7应用：能在条件优越的实验室作常规分析，主要用于鉴定常规方法，评价其误差大小、干扰因素并决定是否可以被接受；用于鉴定二级标准品和为质控血清定值；用于商品试剂盒的质量评价。8（三）决定性方法definitivemethod定义：是指准确度最高，系统误差最小，经过详细的研究，没有发现产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法，其测定结果与真值最为接近。主要方法：重量分析法、中子活化法、同位素稀释-质谱分析法（ID-MS）9应用：由于技术要求太高，费用昂贵，这类方法不直接用于鉴定常规方法的准确性，只用于评价参考方法与一级标准品。储氢重量分析仪(北京英格海德分析技术有限公司)10项目决定性方法参考方法钙ID-MS原子吸收分光光度法氯电量滴定法、中子活化法电流滴定法镁ID-MS原子吸收分光光度法磷ID-MS钾ID-MS、中子活化法火焰光度法钠重量分析法、中子活化法火焰光度法白蛋白免疫化学法总蛋白双缩脲法肌酐ID-MS、离子交换层析法离子交换层析法尿素ID-MS尿素酶法尿酸ID-MS尿酸酶法（紫外法）胆红素——重氮反应法葡萄糖ID-MS己糖激酶法胆固醇ID-MSAbell-Kendall法，胆固醇氧化酶法甘油三酯ID-MS酶法AST（GOT）——MDH-NADH法ALT（GPT）——LDH-NADH法转肽酶（r-GT）——连续监测产物生成法肌酸激酶——NAD+偶联法11二、实验方法选择的目的1.结合自身条件，按照实验方法原则选择合适的项目方法2.临床应用前初步评估方法分析性能和可能引入的误差12三、实验方法选择的原则1.实用性：微量快速、费用低廉、易于自动分析、安全可靠2.可靠性：较高精密度、准确度和较大的检测能力13四、实验方法选择的步骤1.提出要求2.收集资料3.选择候选方法4.确立质量目标5.进行初步评价14第二节试剂盒的选择一、试剂盒的类型临床生化诊断试剂种类繁多，有液体试剂、干粉试剂、干片试剂，一次性试剂包等液体试剂：临床应用最为广泛1.液体单试剂2.液体双试剂二、试剂盒的选购（了解，自学）三、试剂盒的使用（了解，自学）15第三节检测系统性能评价方法性能评价主要内容：精密度、正确度、线性范围、检测限、抗干扰能力、生物参考区间等16在相同条件下，对同一样本连续进行n次重复测定结果的符合程度。在有限次测定情况下，一般用（总体标准差）的估计值S（样本标准差）和变异系数CV来表达这种精密度。定义：一、精密度评价17批内精密度试验：指在相同条件下（同样方法、同一种试剂和标准品、同样仪器、在同一实验室由同一人操作，并要保持实验期间准确性不变）对同一标本在尽可能短的时间内进行m轮n次重复测定结果之间相互接近的程度。重复性（批内）精密度（Sω）ΣSi2mSω=Si=Σ(xt-xt)2n-1CV=SωX×100定义：重复性试验是评价精密度常用方法，包括：(一)基本方法18日间精密度试验定义：将同一样本分成数份，随机插入常规患者样本中，每天测定一次，最少连续测定20天，计算均值、标准差、变异系数。191.试验条件稳定2.实验标本应与真实标本有同样基质3.检测系统应处于良好状态(二)精密度评价注意事项：(三)性能可接受性判断：1.国家行业标准WS/T403-20122.美国标准CLIA’8820二、正确度评价定义:1.大批检测结果均值与真值的一致程度2.指测定结果与真值接近的程度，一般用偏差和偏差系数表示。表示方法:偏倚为重复测定均值（X）与真值之差。偏倚系数（CB）=×100。｜真值-X｜真值定量的标准品确认的标准方法或1.正确度2.准确度21影响因素：系统误差、随机误差（了解）Σ表示已定系统误差的综合。A=Σ+Δα（不确定度）不确定度（uncertainty）是表达测定结果的一个组成部分，它表明被测标本中真值存在的范围22特异度和干扰即专一性，是指在特定实验条件下分析试剂只对待测物质起反应，而不与其它结构相似的非被测物质发生反应。分析方法特异度越高，则测定结果越准确。特异度（specificity）是指标本中某些非被测物质本身不与分析试剂反应但以其它形式使待测物测定值偏高或偏低，这些非被测物质称为干扰物。干扰（interference）特异度干扰方法的准确性侧面指标正面指标23（一）重复性试验试验的目的:试验的方法:对同一材料（标准液、质控液、标本等）分成数份试验标本进行多次分析测定，并计算其均数、标准差与变异系数。检测候选方法的随机误差（1）批内:标准液（2）日内:（3）日间:质控液（4）平行双份:试验的形式:应注意的问题:（1）分析标本选择（2）被测物浓度24(二)回收试验试验的目的:试验的方法:将被测物标准液加人病人标本中，成为分析标本；原病人标本中加人等量的无被测物的溶剂作基础标本；然后用候选方法测定并得到各自浓度。检测候选方法的比例系统误差。回收:指候选方法准确测定加入常规分析标本的纯分析物的能力。25回收浓度=分析标本测得浓度-基础标本测得浓度（实际测得值）计算:加入浓度=标准液量病人样品量（ml）＋标准液量（ml）×标准液浓度（理论真实值）回收率（%）=回收浓度加入浓度×100（理想值为１００％）比例系统误差＝１－回收率＝＝真实值－测定值真实值误差值真实值26注意事项：吸量准确；加入标准液后，其实验样品的被子测浓度最好达到医学决定水平；总浓度必须在方法分析范围内；需加入高中低不同浓度回收试验，计算平均回收率；加入标准液的体积一般在10%内；重复2-3次。27干扰试验试验的目的:用来检测候选方法的恒定系统误差。干扰物浓度不同，误差大小也不同干扰:指标本中某些非被测物质本身不与分析试剂反应但以其它形式使待测物测定值偏高或偏低。28试验的方法:基本与回收试验一样，但在病人标本中加人的是疑有干扰或非特异性反应的物质。将可能引起干扰的物质配成一定浓度的溶液，加到病人标本中成为干扰分析样本；原病人标本加人相同量的无干扰物质的溶剂作为基础样本；然后用候选方法对此两种样本同时测定，两者之差即表示该干扰物质产生的干扰所引起的误差，即干扰值干扰值=分析标本测得浓度-基础标本测得浓度计算:29注意事项被试验的物质：胆红素、溶血、防腐剂、抗凝剂、药物等可疑干扰物的浓度：干扰物浓度有可能达到病理标本最高浓度值。本试验检测的误差包括方法特异度不高和干扰物作用引起的误差。消除干扰常用方法空白对照：试剂空白：常见标本空白：内空白法和外空白法物理、化学方法分离干扰物双波长或多波长法检测排除干扰误差较大又无法消除，则改进或更换方法。（分析标本就是模拟实际标本）30(四)方法对比试验（熟悉）试验的目的:试验的方法:对一组病人的标本用候选方法和比较方法同时进行分析测定，观察二者之间的差异。这是考验候选方法是否可采用的重要措施。用于检测候选方法的系统分析误差。对所得数据进行分析，可提供系统误差的性质（恒定或／和比例误差）31①在进行临床化学常规方法的评价时，最好选择参考方法作为比较方法②若采用已知偏差法，则有部分误差来自比较方法（与已知偏差一致的那部分误差），剩余的则属于侯选方法。③若采用未知偏差法，分析误差可能来源于二者之一或两者都有，难以分析。比较方法的选择：应注意的问题:统计处理：配对t检验、相关和回归分析直线回归处理：理想的回归为：32三、可报告范围评价定义：观察一种检测方法或一个检测系统的检测范围。检测范围的要求：覆盖宽，至少应该覆盖医学决定水平（一）实验前准备：最理想标本：患者的新鲜低值和高值血清标本。多用人工方法制备。1.试验样本2.确定浓度范围（二）样本检测：随机排列，每个样本测3-4次（三）统计处理:33四、检出限的验证检出限（LoD）检测系统可检测出分析物的最小值空白限（LoB）规定的可能条件下，空白样品被观察到的系列检测结果的最大值验证LoD的程序1.试验样品：空白样品、检测限样品2.测定次数：至少20次3.检测LoB4.结果判断34五、生物参考区间的验证定义：指某项检查结果在正常人群的分布范围，是解释检验结果、分析检验信息的基本尺度和依据。建立生物参考区间的方法:（一）实验前准备1.评价对象的选择2.采集标本：采集的注意事项（二）样本测定（三）结果评价：95%的可信度35医学决定水平定义：对临床诊治疾病具有决定性作用的被分析物质的浓度，是临床上按照不同病情给予不同治疗方案而确定的阈值。作用：１、判断被检对象有病或完全排除被检对象有病。２、确定诊断试验在不同病情时的变化，需要有治疗及判断预后的界值。DL336水平１：提示需要进一步检查的阈值水平２：提示需要治疗措施的界点水平３：提出预后或要紧急处理的界值一个诊断试验一般确定三个决定水平：临床生化检验指标的医学决定水平37第四节检测系统性能验证和确认一、量值溯源的基本原理检测系统是指完成一个检验项目的测定所涉及的仪器、试剂、校准品、消耗品、操作程序、质量控制程序、设备维护程序等的组合。量值溯源通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准，通常是与国家测量标准或国际测量标准联系起来的特性［ISO17511;VIM：1993，定义6.10］量值溯源的目的对于临床实验室定量检测来说，最基本的要求是要保证试验结果足够准确（正确和精密），以保证临床的正确诊断并且具有时间和空间的可比性。量值溯源的基本原理利用参考系统（尤其是参考方法和参考物质）提高检验结果的准确性和可比性参考系统是溯源的基础参考物的量值溯源等级图制造商工作校准品制作商产品校准品常规样品测定结果制造商选定测量方法制造商常设测量方法临床用户的常规测量方法一级参考物二级参考物一级参考测量方法二级参考测量方法SI单位不确定度溯源量值溯源的理想情况是可溯源至国际单位制SI，要溯源至国际单位，必须有一级参考测量程序目前满足上述条件的检验指标有25-30种定义明确的小分子化合物（如某些电解质，代谢产物和底物类、甾体激素、甲状腺激素）检测不能溯源到SI的情况有国际约定参考测量程序（非一级参考测量程序）和一种或多种用此参考测量程序定值的国际约定校准物质，如GHb有一种国际约定参考测量程序,无国际约定校准物质，如高密度脂蛋白胆固醇一种或多种国际约定校准物质及定值方案，无国际约定参考测量程序，如抗体和肿瘤标记物等300多种指标既无参考测量程序也无校准的参考物质临床实验室的溯源欲使医学实验室的测量结果具有溯源性，最直接、简便的途径是进入“不间断的溯源链”参考系统包括三个方面参考方法参考物质参考实验室其中最主要的是参考物质和参考方法