4_生物大分子相互作用分析技术(基础医学与医学实验技术)

第六章生物大分子相互作用分析技术基础医学院刘芸第一节生物大分子相互作用分析的意义第二节常见的生物大分子相互作用分析方法第三节生物大分子相互作用分析新进展（FRET、SPR）主要内容真核生物细胞eukaryoticcell原核生物细胞prokaryoticcell细胞结构cell引言原核生物细胞结构肽聚糖被膜质膜引言动物细胞植物细胞细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核真核生物细胞结构引言细胞中的大分子MacromoleculesinCellsTheapproximatecompositionofabacterialcell.引言分子水平DNAsequenceProteinsStructureFunction?AllCell第一节生物大分子相互作用分析的意义DNAPrimarytranscriptmRNAmRNAInactivemRNAproteinnucleuscytoplasmTranscriptionalcontrolPost-transcriptionalcontrolmRNAdegradationcontroltranslationcontrolactiveproteinPost-translationcontrol基因表达的调控层次ProteincomplexSignalingnetwork生命机制蛋白质组学的分类表达蛋白质组学Quantitativestudyofproteinexpressionbetweensamplesthatdifferbysomevariable结构基因组学Goalistomapoutthe3-Dstructureofproteinsandproteincomplexes功能蛋白质组学Tostudyprotein-proteininteraction,3-Dstructures,cellularlocalizationandPTMsinordertounderstandthephysiologicalfunctionofthewholesetofproteome.蛋白质结构和序列特点蛋白质进化过程和保守序列蛋白质表达谱蛋白在细胞内的定位及其相关联的细胞器或结构蛋白质翻译后修饰情况了解与其相关联的其他细胞蛋白质蛋白质信息的不同层次蛋白质同源二聚体(homodimer)蛋白质异源二聚体(heterodimer)蛋白质多聚体(polymer)蛋白质-DNA复合物(protein-DNAcomplex)蛋白质-脂质复合物(protein-lipidcomplex)蛋白质-RNA复合物(protein-RNAcomplex)DNA-DNA复合物(DNA-DNAcomplex)……生物大分子复合物的类型第二节生物大分子相互作用分析技术1.研究思路2.分类3.技术介绍生物大分子相互作用分析研究思路鉴定与目标分子相互作用的所有可能大分子详细描述其生物功能及相互作用对其功能的影响鉴定出相互作用且在生理状态下得到了验证和合理的解释GST融合蛋白技术(GSTpull-down)免疫共沉淀(Immunoprecipitation,Co-IP)串联亲和纯化(TandemAffinityPurification，TAP)酵母双杂交系统(Yeasttwo-hybrid)噬菌体展示(Phagedisplay)细胞内蛋白质共定位(Co-localization)荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)表面等离子共振(surfaceplasmonresonance，SPR)……生物大分子相互作用分析技术1.GST融合蛋白技术（GSTpull-downassay）——基于重组蛋白表达纯化技术的体外分析系统基本原理：是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathioneS-transferase)GSTpull-downassayPurificationofproteinGlutathionecolumnGlutathionebeadGSTfusionproteinTagsPull-Down方法的组成RtagbaitpreyResin——树脂Bait——诱饵蛋白Prey——捕获蛋白Tags——标签（GST,His,Flag,HA,MBP）RPull-downexperimentRWashRRAddpreyWashElutionAnalysisBaitPreyControlsRAddpreyWashRRElutionAnalysisSCSDS-PAGEgel实验设计思路GSTXY谷胱甘肽-琼脂糖微珠细胞裂解物tube4℃下孵育2hGST融合蛋白GSTXY+实验流程GSTpull-down应用鉴定未知相互作用的蛋白鉴定预测的或已知的相互作用GSTpulldown验证两种已知蛋白质（X-Y）的相互作用举例inputGSTY-GFP+++X-GSTY-GFP105kDAnti-GFPX-GFP+++GSTinputAnti-GFPY-GSTX-GFP2.免疫共沉淀（immunoprecipitation，Co-IP）——非常有效地用于鉴定细胞内生理上的蛋白质相互作用的分析技术免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。基本原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。GagaroseGagaroseXYGagarose实验设计思路实验流程SDS-PAGEProteinA/GSepharose＋＋诱饵蛋白质抗体离心诱饵蛋白质ProteinA/GSepharose离心传统方法交联方法基础：细胞在非变性条件下裂解时，完整细胞内许多蛋白质之间的结合保持下来。要求：在一系列操作过程中保持蛋白质复合体不变缺点：可能检测不到细胞内处于动态平衡中的低亲和与瞬间的相互作用,存在着免疫球蛋白的污染，需要培养大量的细胞局限：仅应用于从细胞中溶解出来仍存在于生理复合物中的蛋白质Co-IP应用鉴定已知蛋白质相互作用的检测鉴定新蛋白质间的相互作用免疫共沉淀验证两种已知蛋白质的相互作用Y-GFPY-GFP+X-HAIP:HAcontrolIgGAnti-GFPAnti-GFPAnti-HAY-GFPinput举例3.串联亲和纯化（TandemAffinityPurification，TAP）a.One-stepaffinitypurificationb.Two-stepaffinitypurification(tandemaffinitypurification)Affinitypurification(immunopurification)——融合了标准生化纯化和免疫共沉淀策略的极为有效的快速纯化蛋白质复合物的方法串联亲和纯化技术的优势与传统的生化纯化方法相比与免疫共沉淀方法相比使用恒定的标签和标准纯化条件避免了每次都要设计新纯化方案的问题多步骤纯化降低了细胞高丰度蛋白质以及免疫球蛋白的背景污染双亲和标签：ProA（葡萄球菌蛋白A的两个免疫球蛋白IgG结合单位）CBP（钙调蛋白结合肽）实验设计思路实验流程钙调素结合肽TEV酶切位点在Ca2+离子下结合TEV酶切用EGTA洗脱靶蛋白结合于IgG珠子充分洗涤后，在TEV蛋白酶作用下洗脱结合物钙离子存在下，将首次洗脱物中的蛋白质结合于钙调蛋白包被的珠子上充分洗涤后，加入EGTA洗脱结合物4.酵母双杂交（yeasttwo-hybridsystem）——基于在转录水平上的直接在酵母细胞内检测蛋白质之间相互作用的遗传学方法基本原理：基于对真核生物调控转录起始过程的认识。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。典型的真核生长转录因子，如GAL4都含有二个不同的结构域：DNA结合结构域（DNA-bindingdomain，BD）和转录激活结构域（transcription-activatingdomain，AD）。酵母双杂交（yeasttwo-hybridsystem）三个基本组成部分1.表达诱饵蛋白的载体，诱饵即我们感兴趣的蛋白，它和DNA结合结构域融合。2.表达靶蛋白的载体，靶蛋白可以是一个已知的蛋白，也可以是cDNA或基因组文库编码的蛋白。靶蛋白和转录激活结构域融合。3.一个或多个报告基因（如控制氨基酸合成的基因、大肠杆菌的lacZ基因等），位于DNA结合结构域识别的调控区的下游。ADDBDgene+reporterMeasurableproduct+DBDbaitADprey实验设计思路Target:未知蛋白或将研究對象+DNAbindingdomainBait:已知蛋白+activationdomainTarget与Bait可互换转入同一个酵母菌中ConstructtargetplasmidandbaitplasmidTransformationScreeningDNAextractionDNAsequencingYeastTwo-HybridAssaynucleushis-leu-trp-MeasurableproductDBDbaittrpADfishleureporterhisHISlacZ优势：酵母双杂交方法的优势及缺陷采用酵母菌株敏感度高蛋白折叠易于筛选应用范围广缺陷：核内作用假阳性假阴性转化率酵母双杂交方法的应用高灵敏度地检测蛋白－蛋白的相互作用确定蛋白相互作用的结构域或重要活性位点寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白寻找具有药物治疗作用的小分子肽寻找控制蛋白相互作用的化合物蛋白相互作用图谱的绘制举例酵母双杂交前准备工作双酶切验证21kb5kb3.5kb2kb1.5kbM1M:marker1:pGBKT7-BD-X构建诱饵质粒诱饵蛋白的表达X-BDGal4-BD00.511.522.533.54051015202530时间(H)OD600AH109IPO13-AH109BD-AH109检测诱饵蛋白是否有毒性123Westernblot1.Yeast2.BD-yeast3.X-BD-yeast酵母生长曲线1.未转化酵母2.BD-酵母3.X-BD-酵母酵母双杂交结果SD/-Trp/-Leu-Trp/-Leu/-His/-Ade+3-AT（20mM）举例SD/-Trp/-LeuGal4-BD+Y-ADX-BD+Y-ADGal4-BD+Gal4-ADX-BD+Gal4-ADX-β-半乳糖苷酶蓝白斑显色分析举例X-BD+Y-ADX-BD+gal4-ADGal4-BD+Y-ADgal4-BD+gal4-AD酵母双杂交测序结果酵母双杂交得到的阳性克隆子质粒经过DNA测序，由NCBI数据库的BLAST检索cDNA编码的蛋白质举例5.噬菌体展示技术（Phagedisplay）——基于将某个蛋白与其遗传信息之间直接联系的筛选方法噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到