搜索
增强fiED无标记检测三磷酸腺苷基于核壳Ag@SiO2核壳纳米粒子fl荧光传感器摘要对于重要生物分子的高敏感性和选择性荧光检测的基于核酸适体的新颖、请便、通用的方法已经引起人们相当大的兴趣。在这里，我们展示了一个无标记适体传感器，它通过利用对紫外线敏感核酸着色剂PG作为荧光指示剂和核壳型Ag@sio2纳米粒子作为金属增强荧光平台。用于水溶液中三磷酸腺苷检测、有ATP存在时，补链DNA或核酸双链被固定到Ag@sio2纳米粒子表面，这个表面能够释放他们的寡聚物至缓冲溶液，造成荧光强度显著下降。由于增强的荧光信号，而向ATP的适体传感器能够在广泛线性范围内完成在14.2nm限制内的检测和在复杂生物样本中展示一个良好的检测性能。这个传感方法是合算的和高效的，因为它避免了荧光标记过程和任何酶的作用。因此，这种方法可能提供了为了决定生物化学和生物医学研究中ATP浓度的一个可选择的工具。关键词无标记银纳米粒子适体荧光检测ATP1.前言核酸适配体探针或传感器具有突出价值在诊断学、治疗学的发展，基因和药物传递（Maetal.，2015；Shietal.，2011）。与其他方法相比，fl荧光方法得到由于其具有高灵敏度、快速分析的独特优势越来越受到人们的重视，并且损伤小样本（鲍里索夫和wolfbeis，2008）。然而，在大多数情况下，这些方法需要一个额外的标记过程标签适体与fluorophores和淬火ERS（唐etal.，2008；Zhouetal.，2014），这是费力的和昂贵的。此外，这些fl荧光淬火分子甚至交替的核酸适配体结合特性（Choietal.，2009）。此外，大多数的电流标记的染料，特别是近红外染料，遭受从照片的稳定性差和低发射强度，最终限制fl荧光方法的进一步改进（达维尔etal.，2013）。拓宽适体的适应性，一个普遍的适体为基础的无标记的荧光fl创作平台的目标检测与fluores荧光扩增fi阳离子的策略是可取的。金属增强荧光（MEF）是公认的新兴技术方面的能力优势明显fi显著提高光学性能的fluorophores和检测灵敏度（达维尔etal.，2013；lakowicz，etal.，2002）。值得注意的是，纳米银（AgNPs）已被广泛认可作为一种理想的MEF信号增强器（阿斯兰etal.，2005）。大多数工作报告都是二维的表面，如银岛fiLMS（SIFS），在载玻片作为固体基质的沉积特征标。例如，王等人。开发一个通用的和无标记的传感器上的应力强度因子，显著地提高其检测灵敏度fi通过MEF的影响（Wangetal.，2015）。它已被广泛接受，使用胶体悬浮液细胞成像和传感比其流动性美德固体基质更为合适（Geddesetal.，2003）。不幸的是，等离子体控制fl荧光增强体溶液少见，主要是由于不同的fi困难准备合适的纳米结构（明等人，2012）。虽然优秀的光学和结构性能的多层核壳公司的“空壳”纳米二氧化硅纳米颗粒提供了一种很有前途的前景（庞等人，2015，张等，2010），在水溶液中的生物化学应用的探索，仍然保持在一个非常早期的阶段。三磷酸腺苷（ATP）的各种能量代谢是至关重要的，细胞内的信号转导和生化途径（Zhouetal.，2012）。目前，基于酶的fl荧光传感方法，如级联放大器的fi阳离子策略，具有灵敏度高达皮摩尔水平（Luetal.，2011；薛etal.，2013）。然而，这些方法通常依赖dyemodifiED的寡核苷酸，昂贵的酶和多步操作，大大限制了其实际应用。最近，为了解决这些弊端，几无标记fl荧光学，涉及具体fiC核酸染料，已被开发（Chenetal.，2015；香港etal.，2013；LVetal.，2013；魏etal.，2015）。例如，基于目标从DNA双链和单链DNA形成自由互补的核酸适配体诱导释放（cDNA），一个简单的和具有成本效益的ATP检测传感器采用SYBRGreenI（香港etal.，2013）。然而，由于在无标记的大多数方法灵敏度低，ATP酶的新型传感系统fi阳离子自由放大器的发展战略将是迫切需要的。在这里，我们报告一个标签fl我自由发展荧光传感器基于MEF对ATP的利用率为核心的超敏–壳Ag@SiO2纳米粒子（PG）微量的双链DNA（dsDNA）。的Ag@SiO2纳米粒子能有效地提高在水溶液中的激发态flPG的荧光强度，导致灵敏度的提高。据我们所知，这是fiRST基于无标记细胞在水溶液中的小分子检测传感器。通过对其放大fl荧光信号的能力，该方法有望提高目标的检测具有高灵敏度和大动态范围的发展。2.实验2.1化学品和仪器在这项工作中使用的所有化学品的分析级和直接使用而无需额外的普里fi阳离子。聚乙烯吡咯烷酮（PVP¼55000兆瓦）、正硅酸乙酯（TEOS），氨基硅烷（3-APTS），2,4,6-trichloro-1,3,5-triazine、ATP、5磷酸鸟苷′（GTP），胞嘧啶5′-磷酸（CTP）、尿苷5磷酸′（UTP），和RPMI1640细胞培养基是从西格玛奥德里奇购买（上海，中国）。PG是购自Invitrogen公司（北京，中国）。水净化fiED与Milli-Q水净化系统fi阳离子（微孔，米尔福德，MA，USA），并有一个电阻418.2米Ω。ATP结合的核酸适体（ABA）和cDNA的合成和纯化fi从上海新兴技术方面的能力优势明显fi显著提高fluorophores和光学性质检测灵敏度（达维尔etal.，2013；lakowicz，etal.，2002）。值得注意的是，纳米银（AgNPs）已被广泛认可作为一种理想的MEF信号增强器（阿斯兰etal.，2005）。大部分作品至今已涉及二维表面，如银岛fiLMS（SIFS），在载玻片作为固体基材的特征沉积银。例如，王等人。开发一个通用的和无标记的传感器上的应力强度因子，显著地提高其检测灵敏度fi通过MEF的影响（Wangetal.，2015）。它已被广泛接受，使用胶体悬浮液细胞成像和传感比其流动性美德固体基质更为合（Geddesetal.，2003）。不幸的是，等离子体激元fl荧光增强体溶液少见，主要是由于不同的fi困难准备合适的纳米结构（明等人，2012）。虽然良好的光学和结构性能的多层核心-壳公司@二氧化硅纳米颗粒提供了一个有前途的前景（庞等人，2015；张朝阳等，2010），在水溶液中的生物化学应用的探索仍然处于非常早期阶段。2.2ATP检测关于核心–Ag@SiO2纳米粒子壳制备cDNA和DNA到二氧化硅壳表面的固定化的详细信息位于补充资料部分。ATP测定在0.5mlPBS缓冲溶液中进行。不同数量的ATP（0至10毫米）被添加到dsDNAAg@SiO2纳米粒子的8nm的二氧化硅壳的厚度（0.11nm）在PBS缓冲溶液和RPMI1640培养基。这两种混合物溶液预孵育37°C为15分钟，然后加入PG（200纳米）。最后，生物测定系统的荧光记录以上孵育10分钟。（A）所制备的银二氧化硅纳米颗粒的透射电子显微镜图像，与二氧化硅壳厚度为872纳米。（B）荧光光谱和光秃秃的银粒子（曲线1）；基因/适体双链和裸Ag@SiO2纳米粒子（曲线2）；PG与dsDNAAg@SiO2纳米粒子混合（曲线3）在PBS缓冲溶液（PBS20毫米，100毫米10毫米的NaCl，KCl，1毫米氯化镁，0.1%吐温20，pH7.4）。【PG】¼200nm，40nm¼[dsDNA]、[Ag@SiO2纳米粒子]¼0.11nm和[dsDNAAg@SiO2纳米粒子]¼0.11nm。3.结果与讨论3.1荧光传感器的原理及特性拟议的传感机制中示出了计划1。PG是一种市售的超敏感fl荧光核酸染色检测dsDNA。与dsDNA在复杂的PG可以产生超过1000倍的fl荧光增强，而小fl荧光的变化可以观察到在结合单打交联DNA（ssDNA）（歌手etal.，1997）。相比于免费的PG和PG/DNA复合物，更强的MEF效应只是观察PG/双链DNA复合物上的应力强度因子（德拉甘etal.，2010；Wangetal.，2015）。在我们的设计中，二氧化硅壳可以控制PG/双链DNA复合物在水溶液中的一个优化的MEF影响银奈米粒子表面之间的分离距离提供刚性和精确的间隔。在ATP的情况下，PG可插入的cDNA双链/适体和CONfiNEAg@SiO2纳米粒子的表面，其中PG变成兴奋状态，进一步显示了很强的fl荧光。相反，在加入ATP，高度特异fiC相互作用的核酸适配体与靶之间可以防止PG/DNA复合物的形成，导致一个显fi不能减少的荧光张力。因此，分析ATP可以通过监测fl荧光强度变化来实现。一个直径约50nm的水溶性纳米银被选为金属芯。为了获得一个距离，均匀二氧化硅隔壳表面上生长制备的银和TEOS的量进行了仔细的调整控制壳厚。由此产生的结构进行了观察用HR-TEM（图。1A，S1）。给定大折射率硅壳和等离子体振子振荡能量的降低（Bardhan，etal.，2008），该等离子体共振峰的红移从424到448nm也被观察到（图2）。核壳结构在提供易用性的表面基因中发挥了积极的作用共轭。的2,4,6-trichloro-1,3,5-triazine用于创同时三嗪官能Ag@SiO2纳米粒子的cDNA的IM—共价连接动员。取壳厚度8纳米作为一个例子，相对比例的基因到银@二氧化硅是计算为约402738个基因分子每银二氧化硅。结果，有一个明显的吸收260nm和fl荧光发射峰（λEM¼525nm）时和PG混合（图三），说明成功的固定化的基因在银的表面上的“银”的二氧化硅纳米颗粒（路等，2014；庞等，2015）。下列ATP适配体序列选择曾加和绍斯塔克进行工作（曾加和Szostak，1995）。获得激发态的，致密的单—双链cDNA/适体层形成的NP表面，其中的杂交电台被计算为90.4%。因此，当PG混合与dsDNAAg@SiO2（PG/dsDNAAg@SiO2），该fl荧光发射强度（λEM¼525nm）能显著降低fi增加，表现出约提高5.8褶皱与对照实验相比（图1B）。鉴于蚀刻银芯需要剧毒氰化物，改变本地控制样本含有PG/双链DNA相同和光秃秃的银纳米颗粒进行了类似的报道（路等，2014）。TCSPC技术（图四）的fl荧光衰减曲线（λEM¼522nm）进行也观察到的时间相关的单光子计数（TCSPC）技术（图四）。平均fl荧光寿命PG/dsDNAAg@SiO2（0.124ns）比PG/dsDNA（0.318纳秒）。这种下降的趋势是按照以前MEF现象报道（阿斯兰等，2007），这表明fl荧光发射的PG位于激发态银核的表面是由MEF效应增强。鉴于我们所提出的方法依赖于fl荧光减少，重要的是要确保变化的fl荧光强度可以归因于特定的fiC—目标和适体而不是去相互作用—染料分级。因此，我们研究了光的稳定性dsDNAAg@SiO2纳米粒子之前，加入ATP后他们相比PG/dsDNA裸Ag@SiO2纳米粒子（图五）。通过监测的fl荧光强度的变化作为一个功能的时间，我们发现，传感系统不能很容易地—打断了在测试期间，反对fi证明我们的策略是可行的。3.2传感条件优化考虑到硅壳厚度的银二氧化硅纳米颗粒至关重要的是fl荧光的增强以及检测灵敏度，我们调查的二氧化硅壳厚度的变化一个优化的fl荧光猝灭效应的fi效率（图六）。许多以前的报告确定，最佳的空间距离为强fl荧光增强约2–20nm银奈米粒子的表面（Baietal.，2013；Luetal.，2014；杨等人。，2011）。因此，271纳米，872纳米和不同的壳厚1673纳米被选中。8纳米的壳的厚度表现出最好的fl荧光猝灭效应的fi效率较2nm16纳米。因此，8纳米作为优化的硅壳厚度用于以下研究。为了加快进度，不同的预孵育时间之间ATP和dsDNAAg@SiO2纳米粒子进行了研究（图七）。根据结果，这fl荧光强度下降较快0分钟到15分钟，几乎被夷为平地。因此，15分钟的孵育时间是在引进前选择进入传感系统。（A）在不同浓度的ATP存在的纳米传感器的荧光光谱：（a）–（h）0nm，100nm，1μm，10μm，100μm，1毫米，5毫米，10毫米。插图显示（F0F0与–F）/ATP浓度相应的对数