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第六章第四节生物化学方法及其在中医研究中的应用一．生物化学的主要实验方法有哪些？答题要点：（一）生物大分子物质的分离和提纯生物大分子主要指蛋白质、核酸、糖类和脂类等物质。制备高度纯化的生物大分子是研究大分子结构与功能的前提，整个分离提纯过程可分为以下几个阶段：1．材料选择。原则是：选取所需成分含量较高、来源丰富、工艺简单、成本低廉的材料。例如，胰岛素的提取可选择猪胰。还要注意取材新鲜，要进行预处理，对于蛋白质和核酸的提取要在低温条件下进行，防止生物大分子的变性、失活。2．细胞破碎。生物大分子绝大部分存在于细胞内。根据材料来源及实验要求，可选取匀浆器研磨、高速组织捣碎器、反复冻融、超声波破碎、自溶、酶消化、表面活性剂处理法等。3．亚细胞器的分离。各类生物大分子在细胞内分布往往是区域化的。例，DNA几乎全部在细胞核中，电子传递链和氧化磷酸化酶系分布在线粒体，蛋白质合成酶系在内质网（微粒体）上，Na+-K+-ATP酶分布在细胞膜上等，因此细胞破碎后，可以先分离亚细胞器，这有助于制备纯度更高的生物大分子。亚细胞器的分离，一般采用不同密度梯度介质，经差速离心法制备。4．提取。提取过程，首先要使生物大分子与其他物质分离开来，使大分子物质充分释放出来，在此过程中，特别要考虑溶剂性质、pH值、离子强度、介电常数、抽提温度等多种影响溶解度的因素，然后可结合经验并根据具体实验条件灵活地选取某一试剂进行提取。5．分离纯化。刚提取得到的大分子物质，往往是粗制品，含有许多杂质，必须进一步分离纯化。分离提纯各种生物大分子，主要根据各种物质的分子大小、溶解度、带电性、亲和力大小等差异，选用有机溶剂沉淀，等电点沉淀，盐析，层析，电泳，超离心，吸附，结晶等方法。6．浓缩、干燥及保存。经过分离、纯化得到的提取液有时很稀，体积较大，需要采用蒸馏法、冰冻法、吸收法、超滤法等，去除水分而浓缩。最后低温保存，有时还需加入防腐剂或稳定剂，防止生物大分子变性失活。（二）离心技术离心技术是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。这里的悬浮颗粒往往是指制成悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等。离心机转子高速旋转时，当悬浮颗粒密度大于周围介质密度时，颗粒离开轴心方向移动，发生沉降；如果颗粒密度低于周围介质的密度时，则颗粒朝向轴心方向移动而发生漂浮。常用的离心机有多种类型，一般低速离心机的最高转速不超过6000rpm，高速离心机在25000rpm以下，超速离心机的最高速度达30000rpm以上。根据离心原理，可设计多种离心方法，常见下列三大类型：1．差速离心法。通过逐步增加相对离心力，使一个非均相混合液内形状不同的大小颗粒分步沉淀。2．密度梯度离心法。离心前，离心管内先装入分离介质（如蔗糖、甘油等），使形成连续的或不连续的密度梯度介质，然后加入样品进行离心，具体又可分为：1）速度区带离心法。离心前，离心管内先装入蔗糖、甘油、CsCl、Percoll等密度梯度介质，待分离样品铺在梯度液的顶部，离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心，利用各颗粒在梯度液中沉降速度或漂浮速度的不同，使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。本法可分离各种细胞、病毒、染色体、脂蛋白、DNA和RNA等生物样品。2）预制梯度等密度离心法。要求在离心前预先配制管底浓而管顶稀的密度梯度介质，常用介质有蔗糖、CsCl、Cs2SO4等，待分离样品一般铺在梯度液顶上，如需挟在梯度液中间或管底部，则需调节样品液密度。离心后，不同密度的样品颗粒到达与自身密度相等的梯度层，即达到等密度的位置而获得分离。3）自成梯度等密度离心法。某些密度介质经过离心后会自成梯度，例Percoll，可迅速形成梯度，CsCl、Cs2SO4和三碘甲酰葡萄糖胺经长时间离心后也可产生稳定的梯度。需要离心分离的样品可和梯度介质先均匀混合，离心开始后，梯度介质由于离心力的作用逐渐形成管底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时，可以带动原来混合的样品颗粒也发生重新分布，到达与其自身密度相等的梯度层里，即达到等密度的位置而获得分离。3．沉降平衡离心法。根据被分离物质的浮力密度差别进行分离，所用的介质起始密度约等于被分离物质的密度，介质在离心过程中形成密度梯度，被分离物质沉降或上浮到达与之密度相等的介质区域中停留并形成区带。（三）层析技术层析法又称色谱法，是目前广泛应用的一类分离分析技术。它是利用混合物各组分理化性质上的差异，例如吸附力、溶解度、分配系数、带电性、分子大小、亲和力等，使各组分以不同程度分布在二个相中，其中一个为固定相，另一个为流动相，当混合物随流动相通过固定相时，由于各组分受固定相的阻力和流动相的推力不同，而使各组分移动速度各异，以达到分离的目的。主要有：1．根据分离的原理可划分为：1）吸附层析。是利用混合物随流动相通过由吸附剂组成的固定相时，因吸附剂对各组分的吸附能力的不同，而使各组分流动速度不同，将各组分分离。吸附层析根据支持物装填方式的不同有柱层析和薄层层析类，前者常用于分离非极性或极性较小的有机物，后者用于分离氨基酸、类固醇激素等。2）分配层析。利用混合物随流动相（非极性溶剂）通过含极性溶剂的载体组成的固定相时，由于各组分在二相中的分配系数的不同，而使混合物各组分在两相间发生不同的分配现象而逐渐分开。分配层析应用最广泛的是纸层析。3）离子交换层析。离子交换层析是利用离子交换剂作为固定相，离子交换剂是一类具有酸性或碱性基团，能与溶液中的阳离子或阴离子发生交换的不溶性物质，流动相通常是具有一定pH值和一定离子强度的电解质溶液。将混合溶液加入离子交换柱，由于离子交换剂对混合液中各种离子具有不同的亲和力而产生不同的吸附作用，当流动相流经离子交换柱时，可以降低离子交换剂对吸附离子的亲和力而被交换洗脱下来，从而达到分离的目的。4）凝胶层析。以多孔性网状结构的凝胶（葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶等）为固定相装柱，将分子量大小不同的混合组分加入柱，用一种洗脱液作为流动相进行洗脱。小分子物质易进入凝胶颗粒内部使流程延长，大分子物质不能进入凝胶颗粒内而被排阻在外，流程较短，经过一定洗脱时间后，可将混合物按分子大小不同分离开来。5）亲和层析。亲和层析是根据生物大分子与其配基之间具有高度专一性的亲和力而设计的一种层析技术。具有专一亲和力的生物分子对主要有：酶与底物（包括辅酶与辅基）、激素与受体、抗原与抗体、DNA与RNA、凝集素与糖蛋白等，由于结合双方是互配的，因此分子对任何一方均可作为配基，通过化学法连接到载体上作为固定相装柱，将欲分离的混合物（分子对另一方）加入柱，由于分子对双方有高度亲和力而被吸附结合在柱上，其它杂质首先随流动相被洗脱下来，然后改变流动相成分，将吸附结合在柱上的亲合分子洗脱下来。2．根据两相物理状态可划分为：1）液相层析。流动相为液体的层析，如上述各种层析。2）气相层析。流动相为气体的层析。固定相有固体或液体，故又分作气固层析或气液层析。3．根据支持物的装填方式可划分为：柱层析（将支持物装在管子中成柱形，在柱中进行层析），薄层层析（支持物铺在玻璃板上成一薄层，在薄层上进行层析），纸层析（用纸做支持物的层析）。（四）电泳技术带电颗粒在电场作用下，向着其电性相反方向移动的现象称为电泳。由于被分离物质各自的带电性、带电量、分子颗粒大小和形状等的不同，在同一电埸下它们的移动速度各异，经过一定时间电泳后可被分离开来。在电泳过程中，带电颗粒的迁移率在一定条件下与其所带电量、颗粒半径和溶液的粘度相关。此外还有以下因素可以影响物质的电泳迁移率：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度、电渗作用等。目前采用的电泳大致有三大类：显微电泳、自由界面电泳和区带电泳。其中区带电泳应用较为广泛。所谓区带电泳是指在电埸作用下，被分离的各组分在支持物上相互分离为不同的区带。分类如下：1）按支持物的物理性状不同可分为：（1）滤纸及其他纤维纸电泳，（2）粉末电泳，（3）凝胶电泳、（4）缘线电泳。2）按支持物的装置形式不同可分为：（1）平板式电泳，（2）垂直板式电泳，（3）垂直柱式电泳，（4）连续液动电泳。3）按pH的连续性不同可分为：（1）连续pH电泳，（2）非连续pH电泳。（五）光谱技术光谱技术是利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射辅射能的特性，对物质进行定性或定量的一类分析技术。它具有灵敏度高，测定简便、快速，试样不被破坏等优点，是一类最常用的生化测定技术。1．比色分析法比色法是利用有色物质对一定波长的光的吸收特性来进行定量的一种分析方法。在一定浓度范围内，溶液中有色物质的浓度与溶液颜色的深度成正比，用可见光（400-760nm）作光源，比较溶液的颜色深浅度以测定所含有色物质浓度的方法，叫做比色法。常用的有：1）标准对照法。将样品和标准样品溶液在相同条件下分别测定它们的吸光度，计算出试样溶液的浓度。2）标准曲线法。配制一系列浓度不同的标准品溶液，按一定操作方法显色，在选定波长条件下分别测定它们的吸光度，以吸光度为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标，作一条标准曲线或工作曲线。以后只需在相同条件下实验，测定未知样品溶液的吸光度，从标准曲线上求得相对应的浓度值，即为未知样品液的浓度，一条标准曲线，如测定条件不变，可供多次使用，否则应重新绘制。2．分光光度法分光光度是根据被测物质对各种波长光的吸收能力（吸光度或光密度），绘制吸收光谱曲线，不同的物质，分子结构不同，其吸收曲线各有特殊形式，根据曲线的特征，用于物质的定性定量。分光光度法波长范围较大(200-1000nm)，因此，既可用于可见光，也可用于紫外光和红外光的分光测定，故测定物质既可是有色物，也可是无色物，扩大了应用范围。由于分光光法采用单色光器（棱镜），得到单色光，其波长范围比滤光片波长更狭窄，提高了分析的灵敏度、准确度和选择性。所用的仪器721分光光度计、752紫外分光光度计等。3．荧光光度某些物质经紫外光照射能发出比原激发光的频率低，波长长的可见光，这种光称为荧光。各种物质经紫外光激发后能发出的荧光特性与物质的化学性有关。在激发光强度和所通过的溶液厚度不变时，在一定浓度范围内该物质所产生的荧光强度与其浓度成正比。因此，可以用已知浓度的标准与待测样品同样操作，通过测定荧光强度（F），按前述的标准曲线法和标准对照法，求得待测物质的浓度。所用的仪器如国产930型、910型等荧光光度计。4．比浊法比浊法是利用混悬溶液中颗粒对光线产生散射特性进行测定。其测定的理论、方法和计算等类似于比色分析法，因此基本上任何一种光电比色计或分光光度计都能用于比浊测定。（六）分子杂交技术（详见第八节）二．心气虚证血清SOD活性、血清LPO含量和血浆内核酸含量的变化怎样？其意义如何？答题要点：1．心气虚证患者红细胞SOD活性明显下降，而血清LPO含量则显著升高，推测由于红细胞SOD活性下降不能保护心肌免受超氧自由基的攻击，以致产生心气虚的临床症状。2．心气虚患者血浆核酸总量及DNA、RNA含量均低于正常对照组，提示心气虚患者蛋白质合成功能有一定的障碍。三．试述脾虚证主要的物质代谢异常表现。答题要点：1．用柠檬酸刺激前后唾液淀粉酶活性和唾液流量的变化，结果发现正常人酸刺激前后唾液淀粉酶活性多上升，而脾虚病人则酶活性下降，提示脾虚病人腮腺细胞对外源性刺激的反应性降低，这可能是脾虚病人的虚象的表现。2．血清胃泌素和胰淀粉酶活性低下，胃肠蠕动紊乱，小肠吸收功能低下。说明脾虚患者的胃肠功能确有紊乱。3．脾虚患者木糖排泄率较正常人显著降低。脾虚证的食少、腹胀满、大便不调、神疲气短四大主症的分级量比值与木糖排泄率下降有一致性的规律。4．血清淀粉酶及其同功酶和胰脂肪酶均显著下降，且脾气虚的三个主症（食欲减退、食后腹胀与大便溏泄）与胰淀粉酶活性同功酶活性降低呈正相关，脾气虚的胰淀粉酶活性和胰脂肪酶活性与对照组之间有显著性差异，表明胰腺外分泌功能的降低可视为脾气虚证的特异性诊断指标之一，且淀粉酶总活性的降低取决于胰淀粉酶同功酶的下降，而与唾