第三章微生物的代谢调控理论及其在食品发酵与酿造中的应用本章主要内容第一节微生物的代谢与调节的生化基础一、初级代谢和次级代谢二、代谢调节的部位三、与代谢调节有关的酶第二节微生物代谢的协调作用一、诱导作用二、分解代谢物的调节三、反馈调节四、能荷调节第三节代谢控制在工业发酵中的应用一、发酵工艺条件的控制二、菌种遗传特性的改变三、控制细胞膜的渗透性第一节微生物的代谢与调节的生化基础1.代谢概述①新陈代谢:发生在活细胞中的各种分解代谢和合成代谢的总和,即:新陈代谢=分解代谢+合成代谢。新陈代谢又可分为初级代谢和次级代谢。②分解代谢是指把复杂的有机物分子分解成简单的化合物,并释放能量的过程。一、初级代谢和次级代谢③合成代谢是指由简单化合物合成复杂的大分子的过程。④初级代谢是指微生物的生长、分化和繁殖所必需的代谢活动。⑤次级代谢是指非微生物生命活动所必需的代谢活动。2.初级代谢产物①定义:微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质。②举例:氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。③特征:不同的微生物初级代谢产物基本相同;初级代谢产物合成过程是连续不断的。3.次级代谢产物①定义:微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能,或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。②举例:抗生素、毒素、激素、色素等。③特征:不同的微生物次级代谢产物不同;微生物生长到一定阶段才产生。二、代谢调节的部位生物体的新陈代谢活动都是在细胞内进行的每个细胞内分子都不是独立的,而是相互联系分工合作,实际是像一个有一定组织结构的加工厂。细胞工厂的基本机件是生物催化剂—酶微生物细胞体内具有一整套精确、合理、经济、高效的代谢机构。生物体有自我调节的能力。近年来对生物细胞的研究表明:微生物代谢过程的自我调节表现在控制营养物质进入细胞,酶与底物的接触和代谢物的流向等三个环节上。许多化合物代谢所在的部位是受到控制的:(P51图3-1)1、通道2、通量3、限制其基质有形接近三、与代谢调节有关的酶与微生物代谢调节有关的酶有同功酶、别构酶、多功能酶。指具有不同分子结构但催化相同反应的一组酶。不同点:体外:理化性质体内:催化特性、分布的部位、生物学功能每组同工酶中各种酶的异同:相同点:催化相同的化学反应,大多数是寡聚酶。同工酶的定义:(一)同功酶(一)同工酶同工酶的作用:对于适应不同的组织、器官的不同生理需要非常重要;是代谢调节的一种重要方式,它的主要功能在于其代谢调节。同功酶调节同功酶的主要功能在于其代谢调节,在一个分支代谢途径中,如果在分支点以前的一个较早的反应是由几个同功酶所催化时,则分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用。例如,大肠杆菌以天门冬氨酸为前体合成苏氨酸(Thr)、异亮氨酸(Ileu)、甲硫氨酸(Met)和赖氨酸(Lys)的代谢途径中有三种天门冬氨酸激酶的同功酶(AKI、AKII和AKIII)和两种高丝氨酸脱氢酶的同功酶(HSDHI和HSDHII)。其中AKI和HSDHI受到苏氨酸、异亮氨酸的反馈抑制和阻遏,AKII和HSDHII受甲硫氨酸的反馈抑制和阻遏;AKIII受赖氨酸的反馈抑制和阻遏。(二)别构酶又称变构酶。有些酶的分子表面除了活性中心外,还具有重要的功能部位——调节中心调节中心可以与小分子的代谢物相结合,使酶分子的构象发生改变,从而影响酶的活性。这种作用叫变构效应(又叫别构效应);具有变构效应的酶叫变构酶,引起变构的小分子物质叫变构剂(调节物)。(二)别构酶变构酶(别构酶)是指一些含有2个或2个以上亚基的寡聚酶,在变构酶分子上,别构效应剂的调节部位一般远离活性中心,但活性部位与调节部位之间或者活性部位之间,存在着相互作用(变构效应,协同效应)。调节物与酶分子的调节部位结合之后,引起酶分子构象发生变化,从而提高或降低活性部位的酶活性使酶活性升高的变构叫正变构,此时的变构剂叫正变构剂(正调节物);使酶活性降低的变构叫负变构,此时的变构剂叫负变构剂(负调节物)。(二)别构酶变构酶的特点:变构酶分子上除了活性中心外,还有调节中心。这两个中心处在酶蛋白的不同部位,有的在不同的亚基上,有的在同一亚基上。变构酶的v-[S]的关系不符合米氏方程,所以其曲线不是双曲线型。已知的变构酶都是寡聚酶。1A2456783[S]50%Vmax100%B[S]90%V[S]10%V=81[S]90%V[S]10%V=3别构酶动力学曲线A.为非调节酶的曲线B.为别构酶的S形曲线别构酶的调节作用:不同的别构酶的调节物分子不同。有的别构酶具有同促效应,有的别构酶具有异促效应,更多的别构酶酶是既具有同促效应又具有异促效应。别构酶的活性中心负责酶对底物的结合与催化别构中心则负责调节酶反应的速度。(三)多功能酶多功能酶一般指结构上只有一条多肽链,但具有两种或两种以上的催化活力或结合功能的蛋白质。现已有证据证明,多功能酶是由于部分或完全的基因融合而形成的。对上述同工酶、别构酶和多功能酶的探讨,将有助于阐明代谢过程的调节机制,以便更好的加以控制,使代谢产物得以提高,意义是十分重大的。第二节微生物代谢的协调作用微生物有着精确的代谢调节系统,以保证上千种酶能正确无误地进行催化反应。微生物的代谢调节方式很多,其中以调节代谢流的方式最为重要,它包括调节酶的合成量(“粗调”)和调节现成酶分子的催化活力(“细调”),两者往往密切配合和协调,以达到最佳调节效果通过自然缺损或人工突变获得微生物代谢调控的变异菌株,提供发酵工业用高产菌株一、酶活性的调节酶活性的调节是指在酶分子水平上的一种代谢调节,它是通过改变现成的酶分子活性来调节新陈代谢的速率,包括酶活性的激活和抑制。酶活性的激活系指在分解代谢途径中,后面的反应可被较前面的中间产物所促进。酶活性的抑制主要是反馈抑制,它主要表现在某代谢途径的末端产物(即终产物)过量时,这个产物可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性,促使整个反应过程减慢或停止,避免终产物的过多累积。1.酶活性的激活在激活剂的作用下,使原来无活性的酶变成有活性,或使原来活性低的酶提高了活性的现象。代谢调节的激活作用主要是指代谢物对酶的激活。前体激活是指代谢途径中后面的酶促反应,可被该途径中较前面的一个中间产物所促进。代谢中间产物的反馈激活是指代谢中间产物对该代谢途径的前面的酶起激活作用2.酶活性的抑制抑制和激活相反。由于某些物质的存在,降低酶活性,称为抑制。抑制可以是不可逆的,这将造成代谢作用的停止;抑制也有可逆的,当抑制剂除去后,酶活性又恢复。在代谢调节过程中所发生的抑制现象主要是可逆的,而且大多属于反馈抑制。反馈抑制是指代谢的末端产物对酶(往往是代谢途径中的第一个酶)活性的抑制。反馈抑制作用在生物体内普通存在,它在维持细胞正常代谢、经济有效地利用代谢原料、以及适应环境的变化,都具有重要作用。包括无分支代谢途径的调节和有分支代谢途径的调节。2.1无分支代谢途径的调节无分支代谢途径的调节通常是在线形的代谢途径中末端产物对催化第一步反应的酶活性有抑制作用。例如,在大肠杆菌中,由苏氨酸(Thr)合成异亮氨酸(IIeu)时,异亮氨酸对催化反应途径中的第一步反应的苏氨酸脱氨酶(TD)有抑制作用。2.2有分支代谢途径的调节在有两种或两种以上的末端产物的分支合成代谢途径中,调节方式较复杂,其共同特点是每个分支途径的末端产物控制分支点后的第一个酶,同时每个末端产物又对整个途径的第一个酶有部分的抑制作用,分支代谢的反馈调节方式有多种:(1)同工酶调节;(2)协同反馈抑制;(3)合作反馈抑制;(4)累积反馈抑制;(5)顺序反馈抑制(2)协同反馈抑制指分支代谢途径中的几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式。例如,荚膜红假单胞菌中天门冬氨酸族氨基酸生物合成途径中,天门冬氨酸激酶(AK)是受末端产物赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制。(3)合作反馈抑制指两种末端产物同时存在时,可以起着比一种末端产物大得多的反馈抑制作用。例如,一定量的GMP或AMP仅能抑制5-磷酸核糖-1-焦磷酸酰胺基转移酶活力的10%,而当二者混合时,则可抑制其酶活力的50%。因为这些嘌呤核苷酸与5-磷酸核糖-1-焦磷酸并无结构相似性,又因该酶是一种调节酶,GMP和AMP可能分别结合在该酶的不同部位上。例如,在嘌呤核苷酸的生物合成途径中,催化第一步反应的酶,5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)的酰胺基转移酶,可被各种嘌呤核苷酸产物(如AMP、GMP)所抑制。(4)累积反馈抑制在分支代谢途径中各种末端产物单独过量时,它们各自能对途径中的第一个反应的酶仅产生较小的抑制作用。一种末端产物单独过量并不影响其它末端产物的形成,只有当几种末端产物同时过量时,才对途径中的第一个酶产生较大的抑制。例如,大肠杆菌谷氨酰胺合成酶(GS)活性的调节是一个典型的累积反馈调节的例子。谷氨酰胺由谷氨酸、铵和ATP合成。谷氨酰胺中的酰胺基是色氨酸、组氨酸、氨基甲酰磷酸、6-磷酸葡萄糖胺、CTP、AMP、GMP等化合物生物合成过程中的氮源。谷氨酰胺合成酶被谷氨酰胺代谢的每种末端产物以及丙氨酸和甘氨酸所累积抑制。谷氨酰胺合成酶对这些抑制物中的每一种末端产物均有特异的结合部位。当上述8种末端产物同时过量都与酶结合时,谷氨酰胺合成酶的活性将受到最大的抑制。(5)顺序反馈抑制分支代谢途径中的两个末端产物,不能直接抑制途径中的第一个酶,只有当两个末端产物都过量时,才能对途径中的第一个酶有抑制作用。例如,枯草杆菌在芳香族氨基酸合成中,色氨酸(Try)抑制邻氨基苯甲酸合成酶(AS),苯丙氨酸(Phe)抑制预苯酸脱水酶(PT),酪氨酸(Tyr)抑制预苯酸脱氢酶(PD),预苯酸和分支酸又部分地抑制7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸合成酶(DS)。EP:磷酸烯醇丙酮酸;E4P:4-磷酸赤藓糖;DAHP:7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸;CA:分支酸;Per:预苯酸;AA:邻氨基苯甲酸;HPPA:对羟基苯丙酮酸;PPA:苯丙酮酸;Tyr:酪氨酸;Try:色氨酸;Phe:苯丙氨酸;I:7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸合成酶;II:邻氨基苯甲酸合成酶;III:分支酸变位酶;IV:预苯酸脱氢酶;V:预苯酸脱水酶二、酶合成的调节酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而调节代谢速率的调节机制,这是一种在基因水平上的代谢调节。凡能促进酶生物合成的现象,称为诱导能阻碍酶生物合成的现象,则称为阻遏。举例:亮白曲霉原来不能合成蔗糖酶,所以不能利用蔗糖,但如果在培养基内加入蔗糖,一段时间后,可合成蔗糖酶,并利用蔗糖。两种调节的对比酶合成的调节酶活性的调节不同点调节对象通过酶量的变化控制代谢速率控制酶活性,不涉及酶量变化调节效果相对缓慢快速、精细调节机制基因水平调节,调节控制酶合成代谢调节,它调节酶活性相同点细胞内两种方式同时存在,密切配合,高效、准确控制代谢的正常进行。1.诱导根据酶合成与底物的关系将酶分为组成型与诱导型两类。组成酶是细胞固有的酶,其合成受相应基因控制,与底物、底物结构类似物及环境条件无关,它主要用于调节初级代谢。诱导酶是细胞为适应外来底物或底物结构类似物而临时合成的酶。如E.coli在含乳糖培养基上产生的β-半乳糖苷酶和半乳糖苷渗透酶就是由乳糖存在而诱导产生的。能促进诱导酶产生的物质称为诱导物。底物、难以代谢的底物结构类似物及底物前体均可作为诱导物。酶合成诱导的机制在没有诱导物存在时,调节基因R编码的阻遏蛋白与操纵基因O相结合,使附着于启动基因P上的RNA聚合酶不能通过,从而阻止了RNA聚合酶对结构基因S的转录;当诱导物存在时,阻遏蛋白因受诱导物作用而构型发生变化,失去与操纵基因的结合能力,从操纵基因上解脱下来,使RNA聚合酶能对结构基因进行转录,进而翻译成酶蛋白。2.阻遏在微生物的代谢过程中,当某途径的末端产物过量时,可通过阻碍该代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的生物合成,彻底控制代谢和末端产物合成。阻遏作用有利于微生物从合成源头节省有限的养料与能量。阻遏可分为末端产物阻遏和分解代谢物阻遏。