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翔宇教育集团宝应中学复习教学案选修1—专题1基因工程主备人：杨学志基因工程第1页选修3现代生物科技专题专题1基因工程知识点背诵1．1DNA重组技术的基本工具一、概念：基因工程又叫做DNA重组技术，就是按照人类的要求，把一种生物的个别基因复制出来，加以修饰改造，然后导入另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。二、基因操作的工具：基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工，即对DNA分子进行剪切和拼接，其主要工具有：1．分子手术刀：限制性内切酶，简称限制酶。这种酶主要存在于原核生物中，由于每种限制酶能识别特定的核苷酸序列，因此，限制酶能在特定的切点上切割DNA分子。特点：A、专一性：每一种限制酶只能识别双链DNA分子一种特定的核苷酸序列。B、切点：各种酶切点不同，即具有特定的酶切位点。作用：在特定的切点上切割DNA分子形成两个完全相同的黏性末端。种类：有4000多种限制酶，切割成的DNA末端可分为两大类：黏性末端和平末端(中轴线切口为AT，CG)2．分子缝合针：其实质是一种DNA连接酶。作用：是把两个黏性末端之间的缝隙“缝合”起来。（实质是“缝合”磷酸二酯键）酶的分类：A、Ｅ．coliDNA连接酶(从大肠杆菌中分离得到，只能对互补链的黏性末端起作用)B、T4DNA连接酶（对两种末端都起作用）DNA连接酶与DNA聚合酶的异同：（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键，在DNA复制中起作用；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键，在基因工程中起作用。（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，因此DNA连接酶不需要模板。二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。3．目的基因的运输工具：运载体(或分子运输车)，借助运载体将外源目的基因送入受体细胞。常用的运载体是质粒，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。作为运载体要符合以下条件：a.对受体细胞的生存没有决定性影响；b.能停留在受体细胞内复制，并稳定保存；c.具有多个限制酶切点，便于目的基因的连接；d.具有某些标记基因，便于筛选、检测。三、重组DNA模拟操作注意：剪刀是模拟EcoRI，用不干胶时，意识到它是模拟DNA连接酶，只能黏连磷酸二酯键处，而不能去黏连碱基对处。1．2基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取：翔宇教育集团宝应中学复习教学案选修1—专题1基因工程主备人：杨学志基因工程第2页1．目的基因的概念：符合人们需要的编码蛋白质的结构基因，2．目的基因的获取方法：（1）从基因文库中获取目的基因A、基因文库概念：将含有某种生物不同基因的多个DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称基因文库。概念理解（实质是：一细菌群体中含有这种生物的不同基因）B、基因文库分类:基因组文库：含有一种生物全部基因（理解：相当国家图书馆）cDNA文库(部分基因文库)：只含有一种生物部分基因（理解：某市图书馆）（2）利用PCR技术扩增目的基因PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术。实施PCR技术的条件：①一段已知的目的基因的核苷酸序列②引物③热稳定DNA聚合酶④原料（脱氧核淦酸核苷酸）⑤能量（ATP）。实施PCR技术的过程可以在PCR扩增仪中自动完成。二、基因表达载体的构建（目的基因与运载体结合），是基因工程的核心步骤基因表达载体的组成：表达载体=启动子+目的基因+终止子+标记基因表达载体的功能:使目的基因在受体细胞中存在，并且遗传给下一代，使目的基因表达和发挥作用启动子：是特殊的ＤＮＡ片段位于基因的首端，它是ＲＮＡ聚合酶的识别和结合部位，用于启动转录产生mＲＮＡ。终止子（相当红色信号灯）：位于基因的末端用于终止转录过程。标记基因：鉴别受体细胞是否已含有目的基因。基因表达载体的构建的步骤：用同一种限制酶去切割质粒和目的基因，露出，加入DNA连接从供体细胞的DNA中分离，如鸟枪法。（3）其它方法方法反转录法：人工合成基因据已知的氨基酸序列合成：反转录合成蛋白质单链DNAmRNA基因DNA序列mRNA氨基酸序列推测推测合成翔宇教育集团宝应中学复习教学案选修1—专题1基因工程主备人：杨学志基因工程第3页酶，形成重组DNA分子。三、将含目的基因的表达载体（重组DNA分子）导入受体细胞1、将含目的基因的导入植物体细胞（1）农杆菌转化法转化的概念：目的基因进入受体细胞内，在受体细胞内维持稳定和表达的过程。农杆菌转化法的原理：农杆菌易感染双子叶和裸子植物，农杆菌的Ti质粒的上的T—DNA可转至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。理解：目的基因搭“顺风车”是借细菌或病毒侵染细胞的过程来进行（P12图1-11）。（2）其它方法：基因枪法、花粉管通道法。2、将含目的基因的表达载体导入动物体细胞方法：显微注射技术。基本步骤：P133、将含目的基因表达载体导入微生物体细胞，如，导入大肠杆菌细胞的基本步骤：（1）Ca２+处理→细菌细胞壁通透性增加→感受态细胞（2）重组表达载体DNA溶于缓冲液中与感受态细胞混合→吸收ＤＮＡ四、目的基因的检测和鉴定（是检测目的基因是否成功导入的关健步骤）(1)检测的意义：鉴别目的基因是否真正导入受体细胞。(2)检测方法：DNA分子杂交技术和抗原-抗体杂交技术核酸分子杂交（即DNA探针法）是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单链的DNA小片段用放射性同位素、荧光分子等进行标记（即基因探针），之后同被检测的基因组DNA（或mRNA）杂交，如果显示杂交带，就表明目的基因已插入染色体DNA（或表明目的基因已转录出了mRNA）。抗原-抗体杂交技术可检测目的基因是否翻译形成蛋白质产品。做抗虫或抗病的接种实验：受体细胞（或植株）表现出特定性状，说明目的基因已导入和完成表达过程。1．3基因工程的应用1．转基因生物转基因生物目的基因目的基因从何来抗虫棉Bt毒蛋白基因苏云金芽孢杆菌抗真菌转基因烟草几丁质酶基因抗毒素合成基因抗盐碱和干旱作物调节细胞渗透压的基因耐寒的番茄抗冻蛋白基因鱼抗除草剂转基因大豆抗除草剂基因降低乳糖的奶牛肠乳糖酶基因生产胰岛素的工程菌人胰岛素基因人2．基因工程与医药卫生生产基因工程药品：如将胰岛素基因导入大肠杆菌，来生产胰岛素。基因诊断与治疗：用带同位素或荧光标记的DNA做探针，利用DNA分子杂交原理检测被翔宇教育集团宝应中学复习教学案选修1—专题1基因工程主备人：杨学志基因工程第4页测标本的遗传信息，来检测病症。3．基因工程与环境保护环境监测：用DNA探针检测饮用水中的病毒含量。净化环境：用假单孢杆菌分解石油4．基因治疗分为体外基因治疗和体内基因治疗。5．基因芯片1．4蛋白质工程的崛起一、蛋白质工程崛起的缘由基因工程在原则上只能生产自然界已经存在的蛋白质，天然蛋白质不一定完全符合人类生产和生活的需要。蛋白质工程的目的：生产符合人们生活需要的并非自然界已存在的蛋白质，例如：（1）干扰素在体外保存困难解决方法：半胱氨酸丝氨酸（2）玉米中赖氨酸的含量低原因是：赖氨酸合成过程中的两个关键酶——天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的活性，受细胞内赖氨酸浓度影响较大，当赖氨酸浓度达到一定量时，就会抑制这两个酶的活性。解决方法：天冬氨酸激酶（第352位）：苏氨酸异亮氨酸二氢吡啶二羧酸合成酶（第104位）：天冬酰胺异亮氨酸二、蛋白质工程的基本原理蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。蛋白质工程流程图：三、蛋白质工程的进展和前景1、进展和前景：例①：科学家通过对胰岛素的改造，已使其成为速效型药品。例②：用蛋白质工程方法制成的电子元件，具有体积小、耗电少和效率高的特点，因此有极为广阔的发展前景。2、蛋白质工程是一项难度很大的工程，目前成功的例子不多，主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构十分复杂。变成变成变成基因DNA氨基酸序列三维结构生物功能预期功能DNA合成分子设计翻译转录折叠中心法则蛋白质工程翔宇教育集团宝应中学复习教学案选修1—专题1基因工程主备人：杨学志基因工程第5页翔宇教育集团宝应中学高二生物复习练习专题1基因工程复习测试卷（一）一、选择题（）1．下列哪项不是基因工程中经常使用的用来运载目的基因的载体A.细菌质粒B.噬菌体C.动植物病毒D.细菌核区的DNA（）2．基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的是A.人工合成目的基因B.目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞D.目的基因的检测表达（）3．在基因工程中，切割载体和含有目的基因的DNA片段中，一般需使用A.同种限制酶B.两种限制酶C.同种连接酶D.两种连接酶（）4．下列哪项叙述不是运载体必须具备的条件A.具有某些标记基因B.决定宿主细胞的生存C.能够在宿主细胞中复制D.有多个限制酶切点（）5．水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中有三种氨基酸构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记。在转基因技术中，这种蛋白质的作用A.促使目的基因导入宿主细胞中B.促使目的基因在宿主细胞中复制C.使目的基因容易被检测出来D.使目的基因容易成功表达（）6．应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是指A.用于检测疾病的医疗器械B.用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子C.合成β—球蛋白的DNAD.合成苯丙氨酸羟化酶的DNA片段（）7．基因工程第一步的一种方法是把所需的基因从供体细胞内分离出来，这要利用限制性内切酶。一种限制性内切酶能识别DNA子中的GAATTC顺序，切点在G和A之间，这是应用了酶的A．高效性B.专一性C．多样性D.催化活性受外界条件影响（）8．作为基因的运输工具——运载体，必须具备的条件之一及理由是A.能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因B.具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达C.具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合D.它的参与才能够使目的基因在宿主细胞中复制并稳定保存（）9．下列平末端属于同一种限制酶切割而成的是A.①③B.①④C.②③D.②④（）10．下列有关基因工程的叙述中，不正确的是A.DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B.基因探针是指用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子翔宇教育集团宝应中学复习教学案选修1—专题1基因工程主备人：杨学志基因工程第6页C.基因治疗主要是对有基因缺陷的细胞进行替换D.蛋白质中氨基酸序列可为合成目的基因提供资料（）11．下列属于PCR技术的条件的是①单链的脱氧核苷酸序列引物②目的基因所在的DNA片段③脱氧核苷酸④核糖核苷酸⑤DNA连接酶⑥DNA聚合酶⑦DNA限制性内切酶A.①②③⑤B.①②③⑥C.①②③⑤⑦D.①②④⑤⑦（）12．下列有关PCR技术的叙述正确的是A.作为模板的DNA序列必须不断的加进每一次的扩增当中B.作为引物的脱氧核苷酸序列必须不断的加进每一次的扩增当中C.反应需要的DNA聚合酶必须不断的加进反应当中D.反应需要的DNA连接酶必须不断的加进反应当中（）13．蛋白质工程中，直接需要进行操作的对象是A.氨基酸结构B.蛋白质的空间结构C.肽链结构D.基因结构（）14．某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶（Amy）基因a,通过基因工程的方法，将a转到马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在。这一过程涉及A.目的基因进入受体细胞后，可随着马铃薯的DNA分子的复制而复制，传给子代细胞B.基因a导入成功后，将抑制细胞原有的新陈代谢，开辟新的代谢途径C.细菌DNA分子较小，可直