7微生物工业菌种与培养基

第一篇微生物工业菌种与培养基第一章菌种与种子扩大培养第一节微生物工业用菌种一、微生物工业对菌种的要求微生物资源丰富，广布于土壤、水和空气等自然界中，其中土壤中最多。现在微生物工业用菌有的是野生型，有的是通过诱变得到的突变体。发展趋势：从野生型变异株自然选育代谢控制育种诱变育种基因工程定向育种（1）所需培养基易得，价格低廉；（2）培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、pH、溶解氧、渗透压等）（3）生长速度和反应速度较快，发酵周期短（4）单产高（选择野生型、营养缺陷型或调节突变株）（5）抗病毒能力强（6）菌种纯粹，不易变异退化，稳定性好（7）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒素），保证安全微生物工业对大规模生产用菌的要求原则：二、工业上常用的微生物微生物在工业上的用途很广，包括化工、医药、食品、水产、国防、纺织、石油勘探及石油化工等方面。微生物的代谢产物多，已超过1300多种，而用于大规模工业生产的不足100多种；微生物酶有近千种，而工业上用的不过40－50种。微生物具有巨大的潜力可挖掘。工业上常用菌种举例：1、常用的细菌大肠杆菌应用：对谷氨酸定量分析，生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。乳酸杆菌应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶等的制作枯草芽孢杆菌应用：生产淀粉酶2、酵母菌种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母红酵母、面包酵母应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白质、生产脂肪啤酒酵母红酵母面包酵母3、霉菌曲霉属应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶应用：酱油、酱类（淀粉酶）米曲霉应用：产糖化酶和蛋白酶、主要用于酿酒制曲和酱油制曲应用：生产甲义丁二酸毛霉应用：可以产生蛋白酶，我国多用于豆腐乳、豆豉等的制作根霉种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉应用：酿酒青霉菌应用：生产青霉素、葡萄糖氧化酶4、放线菌种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素链霉菌应用：各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素三、生产用菌种的保藏及选育（一）菌种保藏1、目的：提高菌种存活率，减少菌种的变异，保持原来优良的生产性能。2、原理：根据菌种的生物生理、生化特点，人工地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态，生长繁殖处于休眠状态。保藏时首先要挑选优良纯种，最好是它们的休眠体（孢子、芽孢等），其次是要创造一个最有利于休眠的环境，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等，以达到降低其代谢活动，延长保存期的目的。3、菌种保藏的方法：斜面保藏法、矿物油保藏法、砂土保管保藏法、真空冷冻干燥法、冷冻法、液态真空干燥法、琼脂穿刺封口保藏法、曲法保藏、麦粒保藏法、无水硅胶保藏法。（1）斜面保藏法：在4℃左右的冰箱保藏，每隔一定时间进行移植培养后再继续保藏，如此反复。优点：方法简单、存活率高，具有一定的保藏效果。缺点：菌种仍有一定的强度的代谢活动条件，保存时间不长，传代多，菌种容易变异。适用菌种：细菌、酵母、防线菌、霉菌（2）矿物油保藏法将生长好的斜面在无菌条件下倒入已灭菌的液体石蜡，油层高于斜面末端1cm，然后放于冰箱中保存。适用菌种：适用于除细菌外的其它菌种（3）砂土管保藏法利用土壤颗粒对微生物起保护作用，提高微生物的存活率。其包括砂土制备和真空抽干两步。适用菌种：产孢子的微生物，对于一些对干燥敏感的细菌（奈氏球菌、弧菌、假单胞杆菌）以及酵母不适用。（4）真空冷冻干燥法先在菌悬液加入保护剂（如：脱脂牛奶、血清等）然后在较低温度下使成冻结状态，最后减压抽干。特点：它是菌种保藏中最有效的一种方法。保存期可达一年至数十年之久，并且存活率高，变异率低。单使手续麻烦，需要一定的设备。适用菌种：对于不长孢子或长的很少孢子的真菌保藏效果不佳。（5）其他保藏方法冷冻法：分低温冷冻（－20℃）与超低温冷冻（－196℃）两种。适用于细菌、真菌、病毒等的保藏液态真空干燥法：菌体在恒温液态条件下进行真空干燥。适用于包括细菌、病毒，特别适用于冷冻干燥保藏效果不佳的菌种。琼脂穿刺封口保藏法：适用于不产孢子细菌的保藏曲法保藏：将麸皮与水按比例混合，灭菌后接入菌种，待孢子长成后即为成曲。将试管放入盛有氯化钙的干燥器中，干燥后低温保藏。适用于有大量孢子的霉菌和某些放线菌的保藏。麦粒保藏法：麦粒灭菌后接入菌液，培养有菌丝或孢子时，置通风、避光、干燥处保藏。适用于一些放线菌、芽孢杆菌、酵母的保藏。无水硅胶保藏法：将细胞悬浮液和等体积的脱脂灭菌牛奶混匀，加入装有无水硅胶的试管中，然后将试管放于干燥器内，室温或4℃保藏。对于细菌和真菌效果都较好。国内外菌种保藏机构菌种是一个国家的重要资源，世界各国对菌种的保藏都极为重视。世界上有700多家菌菌种保藏机构，其中国际知识产权组织承认的法定的保藏机构仅有28家。1、我国的微生物菌种保藏机构1）普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）中科院微生物所，北京，中科院武汉病毒研究所2）农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）中国农业科学院土壤肥料研究所，北京（ISF）3）工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）中国食品发酵工业科学研究院，北京，（IFFI）4）医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）中国医学科学院皮肤病研究所，南京卫生部药品生物制品检定所，北京中国医学科学院病毒研究所5）抗生素菌种保藏管理中心（CACC）中国医学科学学院抗生素研究所，北京四川抗生素工业研究所，成都华北制药厂抗生素研究所，石家庄6）兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）农业部兽医药品检察所，北京2、国外主要的微生物菌种保藏机构1）美国标准菌种收藏所（ATCC）2）美国冷泉港研究所（CSH）3）日本东京大学应用微生物研究所（IAM）4）日本东京科研化学有限公司（KCC）5）日本大阪发酵研究所（IFO）6）英国国立标准菌种收藏所（NCTC）7）美国国立卫生研究所（NIH）8）美国农业部北方开发利用研究部（NRRL）（二）菌种选育1、选育的目的改善菌种的特性，使产量提高，改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用等2、选育的方法：A、自然选育；B、生产选育；C、诱变育种；1、常用的诱变剂：2、诱变育种中需要考虑的若干因素(1)选择合适的出发菌株产量高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度广（2）复合诱变剂的使用单一诱变剂重复使用后突变的效果不好，可用复合诱变剂来扩大诱变幅度，提高诱变效果。（3）诱变剂量的选择致死率取决于诱变剂量，而致死率和诱变率之间有一定的关系。因此可以用致死剂量来作为选择适宜剂量的依据。凡是能增加变异的幅度又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合适剂量。确定合适的剂量要价格多次摸索，一般诱变效应随剂量的增大而提高，但达到一定的剂量后，再增加剂量反而会使诱变率下降。（4）变异菌株的筛选3、新诱变因子及诱变技术（1）低能离子束诱变：离子注入是20世纪80年代兴起的一种表面处理技术。这种相互作用过程大致分为能量沉积、动量传递、离子注入和电荷交换等四个原初反应过程，在10－19－10－13s中间时发生。荷能离子注入除具有Y射线能量沉积引起机体损伤的特征外，还具有动能交换产生的级联损伤，表现为遗传物质原子转移、重排或基因的缺失。还有慢化离子、移位原子和本底元素复合反应造成的化学损伤以及电荷交换引起的生物分子电子转移造成的损伤。离子注入通常采用N+、H+、Ar＋。离子注入生物学效应显示出一些不同于辐射生物学的特征，相当于物理和化学诱变两者相结合的复合诱变效应（2）激光辐射诱变和微波电磁辐射诱变（3）原生质体诱变D、细胞工程育种E、基于代谢调节的育种；组成型突变株的选育、抗分解调节突变株的选育、营养缺陷型等等F、代谢工程育种改变代谢途径、扩展代谢途径、转移或构建新的代谢途径G、基因重组育种；H、蛋白质工程育种；定点突变技术、定向进化技术（易错PCR、DNA随机重组）；J、组合生物合成育种；表型的确定基因基础特定生物体获得希望表型的基因修饰生物K、反向生物工程育种四、防止菌株衰退的措施菌种退化：菌种的发酵能力降低、繁殖能力降低、发酵产品的得率降低1、衰退的可能原因（1）、基因突变（2）、分离现象2、防止菌种衰退的方法A、从菌种选育方面考虑B、尽量减少传代次数C、创造良好的培养条件D、利用不易衰退的细胞传代E、采用有效的菌种保藏方法3.菌种复壮方法①纯种分离法；②淘汰已衰退的个体③采用其它方法：诱变因素处理，再进行单菌落分离；选择合适的培养基第二节种子扩大培养一、优良种子应具备的条件1、菌种细胞的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短。2、菌种生理状态稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率和种子培养液的特性等符合要求3、菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求4、无杂菌污染，保证纯种发酵5、菌种适应性强，能保持稳定的生产能力二、种子扩大培养的任务和培养类型1、任务：获得大量的活力强的种子，以便在发酵罐的发酵培养过程中尽可能地缩短迟滞期。根据菌种生长速度快慢来决定扩大培养的级数；放线菌（生产抗生素）三级放大，（其中链霉素须四级扩大）；细菌生长较快，用二级放大培养（斜面菌种→一级种子摇床培养→二级种子罐培养→发酵罐）2.培养类型⑴静置培养法（厌气性发酵）；⑵通气性培养（好气性发酵）；作为种子扩大培养的方法：①液体培养法（三角瓶摇床震荡或转式培养）；②表面法培养：液体表层；③固态法培养。大规模工业生产的培养方法及特点：园盘制曲机A、固体培养（曲法培养）浅盘固体培养深层固体培养B、液体培养浅盘液体培养液体深层培养：目前几乎所有的好气发酵均采用此法；C、载体培养：用天然（或人工）多孔材料代替麦麸之类固态基质作微生物生长的载体，营养成分可严格控制。D、两步法液体深层培养：在酶制剂和氨基酸生产中应用较多。控制菌体在不同生长期的条件。（营养生长与代谢产物积累时条件不同）三、影响种子质量的主要因素1、培养基：主要是碳源、氮源、无机盐、生长素和水等。选用原则：组分简单，来源丰富，价格便宜，取材方便等。种子培养基是培养菌体的（以菌体增殖为主要目的），应该是糖份少而氮源多些。但种子罐与发酵罐培养基成分趋于一致时，可缩短发酵生产的周期，但在各成分的数量（原料配比上），应根据培养目的而定。2、种龄与接种量3、斜面冷藏时间4、温度：温度直接影响生长和酶的合成；5、pH值：对微生物有明显的影响。各种微生物都有生长和合成酶的最适pH。培养基pH值在发酵时要受菌体代谢的影响。调节方法（使之保持适当的pH值）有三种方法：用酸碱溶液中和法；使用缓冲溶液法；使用生理缓冲剂；6、通气搅拌：（溶解氧的作用：参与菌体呼吸作用）搅拌：促进氧的溶解与营养物质及代谢产物的分散。通气量的多少以溶解氧的多少来衡定（溶解氧浓度应不低于临界溶氧浓度）。通气过程中，影响溶解氧的因素：菌种（丝状影响最大）；培养基性质；培养阶段；发酵罐的结构；7、泡沫：危害：影响微生物对氧的吸收；妨碍CO2的排除；减少设备利用率（有效容积减少）；造成跑料，导致染菌；消泡方法：（1）消泡剂：天然动植物油、石油化工矿物油；改性油，表面活性剂（有机硅聚合物）；（2）机械消泡：（3）改变培养基成分：8、染菌的控制染菌原因：设备、管道、阀门漏损、发酵罐结构“死角”、灭菌不彻底、空气净化不好、无菌操作不严、菌种不纯；9、种子罐级数种子罐级数越少，越有利于简化工艺，便于控制，减少染菌；种子罐级数取决于：①种子的性质（生长繁殖性能）；②孢子瓶中孢子的密度（密度大则级数少）；③孢子发芽及菌丝繁殖速度；④发酵罐中种子的最低接种量；⑤种子罐与发酵罐的容积比；在生产中应注意种龄与接种量：种龄：过老过嫩都不好；细菌以对数生长期为宜（霉菌也是）；酵母以二倍体细胞为好；接种量：依据具体的发酵类型和工艺条件而定。谢谢！作业1、简述大规模工业生产常用的培养方法。2、简述影响种子质量的主要因素。