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专题5DNA和蛋白质技术课题1DNA的粗提取与鉴定一.提取DNA的方法基础知识㈠.提取生物大分子的基本思路选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。㈡.生物大分子：主要指蛋白质、酶和核酸。㈢.提取DNA的基本思路利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。㈣.DNA的溶解性DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反。讨论：1.根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？在NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。当氯化钠的物质的量浓度为2mol／L时，DNA的溶解度最大，浓度为0．14mol／L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出2.如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离。㈤.DNA在酒精溶液中的溶解性㈥.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性1.蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。2.大多数蛋白质不能忍受60－80°C的高温，而DNA在80°C以上才会变性。3.洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响。㈦.DNA的鉴定1.DNA与二苯胺(沸水浴)会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。3.紫外灯照射法⑴.配制染色剂，用蒸馏水配制万分之五的溴化已锭（EB）。⑵.将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上，再滴一滴EB溶液染色。⑶.将蜡纸放在紫外灯(260nm)下照射（暗室中），可见橙红色的荧光(DNA的紫外吸收高峰在260nm处)。2.甲基绿(绿色)。二.DNA的粗提取与鉴定的实验设计㈠.实验材料的选取1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取2～3种实验材料）。2、原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。㈡.破碎细胞，获取含DNA的滤液1、动物细胞答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？2、植物细胞讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？㈢.去除滤液中的杂质讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。㈣.DNA的析出与鉴定DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95％），静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水。1.DNA的析出2.DNA的鉴定鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色。㈠.案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取三.实验案例⑵.鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。1.鸡血细胞做实验材料的原因⑴.鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得。2.实验原理⑴.DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。⑵.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。⑶.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。3.实验材料和用具：鸡血细胞液（5~10ml）；体积分数为95%的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却24h）；蒸馏水；质量浓度为0．１g/ml的柠檬酸钠溶液；物质量浓度分别为2mol/L和0．015mol/L的氯化纳溶液；二苯胺试剂。铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（100ml，一个）；烧杯；（100ml，一个，50ml、500ml各二个）；试管（20ml，二个）；漏斗；试管夹；纱布。4.课前准备鸡血细胞液取质量浓度为0．1g/ml的柠檬酸纳溶液100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，静置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min（转每分）的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）⑴.过程⑵.柠檬酸钠作用防止血液凝固。⑶.作用机理柠檬酸钠能与血浆中的Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液就不会凝固。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的容器盛放鸡血细胞液。⑷.注意事项5.方法步骤将制备好的鸡血细胞液5mL～10mL，注入到50mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒充分搅拌5min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。⑴.提取鸡血细胞的细胞核物质讨论：答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破1.为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？2.用玻璃棒搅拌有什么意义？答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA3.滤去的是什么物质？得到的是什么？答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA⑵.溶解细胞核内的DNA将氯化钠的物质的量浓度为2mol的溶40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态。沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14mol／L）⑶.析出含DNA的粘稠物讨论：加入蒸馏水的目的？降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕.注意事项：⑷.滤取含DNA的粘稠物用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中，含DNA的粘稠物被留在纱布上⑸.将DNA的粘稠物再溶解取1个50mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2mol／L的溶液20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中⑹.过滤含有DNA的氯化钠溶液取1个100mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中⑺.提取含杂质较少的DNA在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为95％的溶液50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA取两支20mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0．015mol／L的溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化⑻.DNA的鉴定讨论：答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色。2.这一鉴定结果说明什么问题？1.比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？答：提取出的丝状物是DNA。3.DNA的直径约为20×10-10m，实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小？答：DNA分子直径只有2nm。丝状物是多个DNA子聚在一起形成的。㈡.案例二：以菜花为实验材料进行DNA的粗提取1、课前准备将新鲜菜花和体积分数为95％的乙醇溶液放入冰箱冷冻室24h。2、提取DNA的具体步骤⑴.取材：称取30g菜花，去梗取花，切碎。⑵.研磨：将碎菜花放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨10min。研磨液的配制方法如下：将10.1gTris加入到50mL蒸馏水中，使其溶解，然后，用2moL/L的HCl溶液调节pH至8.0，再加入8.76gNaCl、37.2gEDTA、20gSDS。待上述药品全部溶解后，再用蒸馏水定容至1000mLTris/HCl:提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态（Tris为三羟甲基氨基甲烷）EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNASDS（十二烷基磺酸钠）：可以使蛋白质变性，与DNA分离⑶.过滤：在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用1000r/min的转速，离心2～5min，取上清液放入烧杯中)。在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液⑷.沉淀：将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95％的预冷乙醇溶液中，并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液(玻璃棒不要直插到烧杯底部)。沉淀3～5min后，可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮状物缠绕在玻璃棒上观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。四.课题成果评价㈠.是否提取出了DNA本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。㈡.分析DNA中的杂质㈢.不同实验方法的比较对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。