中国药科大学新药筛选中心细胞培养基础知识培训材料

细胞培养基础知识培训材料中国药科大学新药筛选中心此材料仅供中心内部使用最终解释权归新药筛选中心细胞培养基本介绍•血清•培养基•其他产品体外培养细胞的分型•贴壁细胞：细胞贴附在支持物表面生长，只有依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞•悬浮细胞：培养时不贴附于底物而成悬浮状态生长，主要来自血，脾或骨髓体外培养细胞•原代培养：直接从体内取出的细胞进行第一次培养，其优点是组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反应体内的状态；缺点是细胞生长较为缓慢，生长条件要求高•传代培养：将细胞从一个培养瓶按照一定比例转移到另外的培养瓶即为传代培养，其目的是将高密度的细胞进行稀释扩大培养，以避免营养枯竭，影响细胞生长贴壁细胞培养基本流程基础培养基+FBS+添加剂+抗生素去除Media用PBS或Trypsin清洗加入Trypsin以分离贴壁细胞将部分细胞传代到新的Media中细胞培养主要成分①血清②基本培养基③细胞培养试剂（抗生素、细胞解离，生长因子等）④平衡盐溶液血清产品及FAQ血清的作用•血清提供：营养和能量来源生长和粘附因子肽和类固醇激素载体蛋白•保护细胞：免受蛋白酶、毒性物质、pH值波动、机械剪切力、氧化及自由基的损伤。血清•血清的来源目前国内可以销售HyClone来自澳大利亚、新西兰、南美的胎牛血清，并且均提供血清来源说明及质量检测报告•血清类型胎牛血清特殊处理的胎牛血清新生牛血清及小牛血清其他血清：成牛血清、马血清、猪血清等胎牛血清替代品•检测体系每批产品都经过严格的细菌、支原体、病毒、内毒素、血红蛋白等检测如何保存和解冻血清？a.血清应该在-20℃保存。如果一次无法用完一瓶，应该无菌分装后冷冻保存。注意：避免反复冻融。b.解冻时将血清首先置于冰箱2-8℃中12-24小时使之缓慢部分溶解，然后再放在室温下使之全溶。注意：溶解过程中要每隔一段时间（2小时）缓慢地摇动血清使之混匀。血清出现沉淀？1.纤维蛋白：是常出现的较大的沉淀物。因为血清都是在低温下进行收集和快速处理的，一些纤维蛋白原（形成絮状纤维蛋白的可溶性前体）在处理过程中仍处于溶解状态，在经过最后的过滤后发生凝结，形成纤维蛋白沉淀。2.磷酸钙：是一种常见的沉淀物，通常会使血清出现浑浊，并且在37℃培养时会增加。这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点，这些小黑点由于布朗运动看上去可以活动，因此经常被误认为是微生物污染3.其他的脂类和蛋白4.血清中的沉淀物是难以预测和预防的，但通常沉淀不会影响血清的质量如何避免血清出现严重沉淀？血清有轻微絮状物，但产品比较澄清或略显浑浊是正常现象，但下属操作会致使血清出现严重沉淀，应尽量避免a.储存不当：反复冻融；长期储存在2-8℃；在室温下放置时间过长b.不正确地解冻操作，融化时没有混匀。c.热灭活血清d.37℃培养血清e.γ射线辐照血清常见问题•如想去除这些絮状沉淀物，可将血清分装到无菌离心管中，以400g离心，上清液即可直接加入到培养液内•不要以过滤的方式去除这些絮状沉淀物，因为这可能阻塞滤膜血清选择？a.尽量使用同批次的血清；如果需要更换血清批次，则需事先验证3代以上，因此建议客户单次购买大量血清；b.原代细胞或ES细胞，提供澳洲或新西兰的FBS不同批次进行试用，选择使用效果好的批次；培养基产品及FAQ培养基•培养基（Medium）是供微生物、植物和动物细胞生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物(糖)、氨基酸、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。•细胞培养液=基础培养基+10%FBS+营养添加剂+抗生素细胞培养液=减血清培养基+2%FBS+营养添加剂+抗生素细胞培养液=无血清培养基+营养添加剂+抗生素培养基和相关产品•普通液体培养基（LiquidMedia，LM）•普通干粉培养基（DryPowderMedia，DPM）•减血清培养基（ReduceSerumMedia）•无血清培养基（Serum-FreeMedia，SFM）•营养成分添加剂（NutrientMediaSupplements）•试剂和辅助产品（ReagentsandCellCultureSupport）普通培养基的应用•BME(BasalMediumEagle):是由Eagle发明的，是最简单的培养基，只有11种氨基酸和盐及一些维生素。最先用于培养小鼠的L细胞和人类HeLa细胞，现在广泛用于各种细胞的培养•MEMorEMEM(Eagle’sMinimumEssentialMedium):是BME的升级版，氨基酸浓度是BME的两倍，适用于更多的细胞•DMEMorDME(Dulbecco’sModificationofEagle’sMedium)是Dulbecco改进的MEM.氨基酸和维生素浓度是BME的4倍.最先葡萄糖的浓度是1g/L，称为低糖DMEM,后来增加到4.5g/L，称为高糖DMEM，广泛用于各种贴壁细胞培养。•IMDM（Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium)由DMEM发展而来，用B淋巴细胞的培养普通培养基的应用•RPMI1640(RoswellParkMemorialInstitute#1640):是McCoy’s5A的改进版，含有高浓度的肌醇。广泛用于悬浮细胞的培养。如人类白细胞，骨髓瘤细胞，杂交瘤细胞等血液来源的细胞•M199(Medium199):是一种比较古老的，配方复杂的，含有核苷酸，核酸等成分的培养基。最初用于鸡胚肌细胞的培养，还用于各种细胞的维持和病毒生产•Ham’sF10(Ham’sNutrientMixtureF10):由Ham发明，用于人类2倍体细胞和仓鼠细胞的培养。•Ham’sF12(Ham’sNutrientMixtureF12):F10的升级版，含有更多的维生素，肌醇，氨基酸。用于培养大鼠，兔子和鸡胚细胞，还用于中国仓鼠卵巢细胞以及肺细胞的培养普通培养基•5大常用培养基•RPMI1640•Dulbecco’sModifiedEaglesMedium(DMEM)•MinimumEssentialMedium(MEM)•Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium(IMDM)•Medium199•培养基提供形式•干粉•液体培养基的选择？a.查询ATCC或文献，参照该细胞之前的培养方案b.实验室常用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞培养；干粉培养基的配制？a.建议当开封一个包装后，请立即将其一次性全部配置；b.我们不建议将干粉培养基或者盐类物质配置成为浓缩液，这样可能会导致某些盐类混合物难融而导致其它沉淀物的增多；c.其它的添加剂可以选择在最终配置和无菌过滤之前加入；如果添加剂是无菌的，则可以直接添加到无菌的培养基。如何储存培养基？a.液体培养基分装后不可以在-20℃下保存;因为培养基中的盐容易析出，而再次融化后，有的盐可能无法重新溶解，从而导致培养基营养成分和渗透压改变，培养细胞时，容易细胞破裂而死亡；b.培养基开瓶后尽快用完，不宜长时间保存，因为时间过长会导致液体培养基中盐分的析出和pH值的改变；培养基PH值偏高？a.干粉配置中调好pH后使用负压过滤；--请使用正压b.液体培养基启封后长时间无法用完；--请尽量快用，或用之前用小体积容器分装（不能在液面上留有太多空气）；c.如结果已经造成；--客户接种前请将装有培养基的培养瓶在CO2温箱孵育（甚至过夜），直到pH恢复正常；d.不建议用HCl调节，增加污染风险和高渗透压结果；碳酸氢钠的作用及含量？1.与CO2一起形成缓冲系统，保持培养基PH值稳定；2.不同的培养基要求添加NaHCO3的量不一样，如DMEM要求添加3.7g/L，为了保持PH值稳定，必须用高浓度的CO2平衡，一般不低于8%，而1640等要求添加NaHCO32.2g/L，还有些培养基要求添加更少，那么这些培养基就要求较低的浓度平衡，一般是5%；HEPES的作用及含量？1.培养基中最常用的Buffersystem是碳酸氢钠，它可提供营养，但却在生理PH值条件下会降低缓冲能力。而HEPES是一种很强的Buffer，加入HEPES能使细胞培养基在PH7.2-7.6条件下缓冲能力增强；2.Hepes在培养基中的终浓度通常为25mM；非必须，根据实验要求进行添加；丙酮酸钠的作用？丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源。但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。保证细胞更好地生长，但非必需成分；谷氨酰胺的作用？a.几乎所有的细胞对谷氨酰胺都有较高的要求。谷氨酰胺脱掉氨基后，可作为培养细胞的能量来源，参与蛋白质的合成和能量代谢。在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。但同时L－谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性；b.谷氨酰胺在溶液中很不稳定，加有谷氨酰胺的液体培养基4度冰箱储存两周以上时，应重新加入原来量的谷氨酰胺；是否含有酚红？1.酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色2.酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）3.由于酚红干扰检测，在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基无血清培养基Serum-FreeMedium（SFM）•成分更加清晰•消除因血清批次不同而带来的不确定性–保持实验的连续性•易于纯化和下游处理•优化特殊细胞及其功能的培养条件•越来越多的无血清培养基用非动物/人来源的原料制造•有利于准确阐述细胞功能,更好控制生理反应•降低成本，控制污染无血清培养基产品体系五大细胞培养平台：CHOCell(仓鼠卵巢细胞)HybridomaandMyelomaCell(杂交瘤和骨髓瘤细胞)HEK293andPER.C6®CellCultureInsectCellCulture(昆虫细胞）ViralVaccineCellCulture(病毒生产用细胞)细胞培养添加剂1.谷氨酰胺&丙酮酸钠2.抗生素---青霉素/链霉素溶液SV300103.非必需氨基酸---根据细胞而定4.胰酶5.平衡盐溶液6.HEPES7.酚红胰酶Trypsin•用途：用于贴壁细胞的消化，使贴壁生长的细胞重新悬浮起来，以便传代•-含或不含EDTA,根据细胞和实验要求选择平衡盐溶液•平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成；它的作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养；•用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等PBS磷酸盐缓冲液DPBS（Dulbecco’sPhosphate-BufferedSalines）Earle’s平衡盐Hank’s平衡盐常见问题处理1.如果细胞培养基偶然被冻，应该融化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基。2.当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。3.大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。4.在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。5.产品说明在超过指定的贮存期的一段时间内，产品仍然在可接受的范围内，但是由于在超过指定的效期后，产品的性能和稳定性没有检测，我们不推荐使用过了效期的产品。细胞生长不好•细胞本身的状态•细胞的接种量：接种量过低，细胞生长缓慢•细胞传代时间过晚：细胞中毒，影响传代后的细胞生长•胰酶消化时间过长或过短：时间过长，细胞死亡；时间过短，细胞未完全分离而成团，细胞死亡•细胞的冻存与复苏：慢冻速溶•污染支原体污染•合适的培养基及培养环境更换血清批次需事先验证