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课题3血红蛋白的提取和分离血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白的特点：1.分离生物大分子的基本思路：选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2.蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。一、血红蛋白的提取和分离（一）凝胶色谱法（分配色谱法）2.凝胶：大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。1.概念：3.凝胶色谱法的原理①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。③依据的特性是：蛋白质分子量的大小。原理：当不同的蛋白质通过凝胶时相对分子质量较小相对分子质量较大凝胶内部的通道容易进入无法进入凝胶内部的通道只能在凝胶外部移动路程较长移动速度较慢路程较短移动速度较快相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示（二）缓冲溶液(洗脱剂)1.概念:在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。2.作用:3.缓冲溶液的配制:.调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________,其目的是:利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)磷酸缓冲液（三）电泳：1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。影响蛋白质分子运动速度的因素决定运动方向电场作用力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√√√√3）常用电泳方法琼脂糖凝胶电泳聚丙酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图聚丙烯酰胺凝胶电泳1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。（SDS的作用）为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。2.原理：SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。3.SDS作用机理:用SDS测定蛋白质分子量的方法使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异二、实验操作•蛋白质的提取和分离一般分为四步：•（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。•（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。•（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。•（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。1.血液有哪些成分？2.你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定血液血浆水分固体物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团3.用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。二、实验操作样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定1.样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。(1)红细胞的洗涤:①洗涤目的:去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。②洗涤操作：1、采集血样。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。(2)血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min。②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。2.释放血红蛋白阅读思考：1.释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？2.为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：1.蒸馏水的作用是______________________________。2.加入甲苯的作用是____________________________。3.充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂甲苯层（无色透明）白色薄层固体红色透明液体杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次对位训练1.为了提取血红蛋白，从学校附近的屠宰场索取新鲜的猪血，对猪血处理的正确操作是（）A.要在采血容器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠B.取血回来后，马上进行高速长时间离心C.将离心后的血细胞加入清水缓慢搅拌D.重复洗涤直到上清液呈红色为止A2.洗涤红细胞时，离心所用方法为（）A.低速长时间离心B.低速短时间离心C.高速长时间离心D.高速短时间离心B(4)透析：①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。该结果说明什么？原理：半透膜能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。透析法透析过程动画演示练习巩固1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是A弄清各种蛋白质的空间结构B弄清各种蛋白质的功能C弄清各种蛋白质的合成过程D获得高纯度的蛋白质2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D二者根本无法比较3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A调节pHB维持红细胞的能量供应C防止微生物生长D防止血液凝固5、一分子血红蛋白最多可携带的O2分子数和CO2分子数分别是A4、2B4、4C2、1D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是：有机溶剂-----脂类物质-----血红蛋白溶液------红细胞破碎物沉淀2.凝胶色谱操作:（1）凝胶色谱柱的制作：①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。（2）凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶,浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。（平衡凝胶是凝胶装填紧密）④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。（2）凝胶色谱柱的装填50cm高注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。装配好的凝胶柱（3）样品加入与洗脱①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。④洗脱：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。（3）样品加入与洗脱注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。思考下面的问题：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常。1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判