丙肝病毒实验室检测进展

丙肝病毒实验室检测进展四川省双流县第二人民医院检验科杜慧摘要1989年Choc等应用分子克隆技术获得HCV病毒基因克隆，并命名本病及其病毒为丙型肝炎（HepatitisC）和丙型肝炎病毒（HCV）。HCV属黄病毒科，为单股正链RNA病毒。其主要通过血源传播，此外还可通过其他方式如母婴垂直传播、家庭日常接触和性传播等。欧美国家多为HCV-Ⅰ型感染，而亚洲国家以Ⅱ型为主，Ⅲ型次之。其传染源主要为急性临床型和无症状的亚临床病人、慢性病人和病毒携带者。人感染HCV后所产生的保护性免疫力很差，会再次感染，部分病人会导致肝硬化及肝细胞癌。故对HCV进行实验室早检测早治疗非常重要。关键词丙型肝炎病毒实验室检测进展实验室检测丙肝病毒的方法主要有抗-HCV抗体检测、HCV抗原检测、HCV-RNA检测。(一)抗-HCV抗体检测1.酶联免疫吸附实验（ELISA）检测原理：ELISA检测抗-HCVIgG系利用固定在固相载体（如普通酶标板、聚苯乙烯试管及小球、磁性微粒子等）上的HCV重组表达和/或人工合成多肽抗原，捕捉待测样品中的抗-HCVIgG，然后，通过加入酶（辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶ALP等）标记的抗-人IgG检测所捕捉到的特异性抗-HCVIgG。1989年美国Chiron公司首先采用重组HCVC100-3融合蛋白包被，建立了第一代HCV抗体检测方法。因其特异性差、灵敏度低很快被第二代抗-HCV试剂盒替代。第二代抗-HCV试剂盒于1990年出现，它以HCV基因组NS3区的C33C和NS4区的融合表达抗原(C200)再加上C区的核心抗原C22-3作为固相包被进行检测。目前实验室使用的是第三代HCV试剂盒，在第二代的基础上,又加入来自NS5区的重组表达抗原，由于重组了病毒基因组的结构区和非结构区的多个编码抗原,提高了检测的灵敏度和特异性,缩短了检测的“窗口期”，但是在使用中也要重视以下问题：1．1样本应避免出现溶血：血红蛋白中含有血红素基团,其有类似过氧化物的活性,会干扰以HRP为标记酶的ELISA法底物显色反应，引起OD值的升高，从而可导致接近临界值的标本出现假阳性[1]。1．2要注意试剂盒的选取：ELISA检测抗-HCV存在着明显的缺陷,主要表现为非特异性反应,产生的假阳性较多。有文献报到对五家国产EIA试剂盒进行评价，其抗干扰能力良莠各半,参差不齐,假阳性率从0.37%～12.68%不等。产生假阳性的原因有以下方面：1.2.1高IgG血症：目前国内外的抗-HCVEIA试剂均采用间接酶联免疫检测原理，间接法的一个重要影响因素是血清中所含的高浓度的非特异性IgG对聚苯乙烯有较强的吸附力，非特异性IgG可吸附到固相载体上或包被的抗原上造成假阳性；1.2.2类风湿因子的干扰：类风湿性关节炎患者血清或血浆中的类风湿因子为巨球蛋白IgM，可非特异性地吸附到固相载体上或包被的抗原上造成假阳性；1.2.3用于试剂制备的HCV抗原不纯：用于生产抗-HCVEIA的HCV抗原主要有HCV核心区、NS3、NS4及NS5区蛋白，均为基因工程产物，如抗原的纯度太低，可产生非特异性反应。在临床实践中,对初检抗HCV阳性的标本,特别是低S/CO比值(S/CO≤2)的标本,要倍加小心,应使用不同于初检试剂的国产或进口试剂盒进行复检[2]。目前临床使用的丙肝抗体ELISA法试剂盒具有操作简便、可批量检测、快速出结果等优点,但是试剂需低温保存,测定时又受标本数限制,不能单份即时检测，技术操作亦有一定难度和经验性.对于抗-HCVEIA报告的问题，亚太地区丙型肝炎病毒感染的诊断、处理和治疗共识中规定，抗-HCV检测应用获得批准的第3代或第4代EIA(酶免疫分析法)EIA检测阴性可报告抗-HCV阴性。但是,应该注意血液透析或HCV-HIV共感染者可能表现为HCVRNA阳性而抗-HCV阴性；单次EIA检测S/Co达到预测真阳性的水平可报告为阳性；单次EIA检测S/Co未达到预测真阳性的水平或接近S/Co值者应考虑HCVRNA定性检测和/或进一步获得样本检测抗-HCV和HCVRNA定性。２．化学发光法检测原理：反应时样本中存在的抗一HCV抗体结合到HCV抗原包被的顺磁微粒子，洗涤后加入丫啶酯标记的抗人IgG的结合物反应。再次洗涤之后,反应体系中加人触发液使丫啶酯发光。通过光学系统测定得到的化学发光反应,样本中的抗HCV数量与系统光学检测的相对光强度成正比。该方法重复性好可批量检测，不足的是为进口封闭试剂，价格较昂贵。３．免疫层析法免疫层析胶体金技术是新型的免疫学检测方法,采用双抗原夹心法,对HCV的Core和NS3抗原进行标记和包被,制备检测试剂。但应注意的是HCV不同来源的诊断抗原、抗原浓度比例和制备工艺都会影响试剂的检测性能[3]；另样本溶血产生的血红蛋白会影响胶体金在硝基纤维膜上的层析过程可引起假阴性，，非特异性的高IgG对固相载体具有较强的吸附力，可引起假阳性[4]。与ELISA相比,该方法具有检测方便、快速、适于现场检测、稳定性好等特点。以上试剂盒包含的HCV病毒的核心区、NS3、NS4、NS5片段,由于抗原载体能吸附的抗原的量是有限的,一旦抗原片段的组合不合适(抗原片段的种类与各片段的含量比例)或抗原之间互相干扰而影响抗原位点的充分暴露,即会降低其检出率；再者基因表达或多肽合成的丙肝抗原也同样存在各抗原片段与其它生物或人体的组织成份基因的部分同源性,而当各抗原片段在包被微孔板时相互叠加,极有可能引起这种同源性程度的增加或减少,从而影响其特异性。于是出现了下述抗-HCV分片段抗体检测。４．重组免疫印迹实验——（Recombinantimmunoblotassay，RIBA）为了对ELISA筛查实验阳性的样品进行确认，Chiron公司推出相应的补充/确认实验，该实验是以待测血清中的HCV抗体和分别固定在硝酸纤维素膜载体上的不同HCV抗原之间的特异性结合反应为基础、通过再加入酶（一般为ALP）标记的二抗来确认样品中抗-HCV的存在和有无；目前，该项技术已经得到了美国食品及药品监督管理局（FoodandDrugAdministration，FDA）的认可，成为HCV抗体确认的国际标准。因为HCV的各种抗原分别被单独固化在载体的不同位置上，因此，该项检测又可以区分待测样品对HCV不同抗原的不同反应性。RIBA试剂可以分别对HCV病毒的核心抗体,NS3、NS4、NS5抗体进行检测,提高了HCV抗体检测的特异性,但由于其操作繁琐,结果无量化且成本高昂,限制了其临床应用。５．生物芯片技术蛋白芯片是近年伴随基因芯片发展起来的一项新技术,这项技术是将蛋白质的分析微缩到小型芯片上,利用荧光或酶显色进行检测,并用电脑进行分析。检测原理：将HCV混合抗原,核心区抗原,NS3，NS4，NS5区抗原分别固定于同一玻片载体上,将检测血清或血浆用样本稀释液稀释10倍,加入蛋白质微阵列反应孔中37℃孵育30min,洗涤后加入Cy3荧光标记的兔抗人IgG。经加样检测操作后的玻片用激光共聚扫描仪扫描成像,与同样处理的标准品进行比较。采用此技术一次实验即可同时检测多种不同功能区的HCV抗体,且丙型肝炎病毒分片段抗体检测蛋白质芯片与进口RIBA确证试剂检测结果具有很高的一致性,说明丙型肝炎病毒分片段抗体检测蛋白质芯片具有理想的检测准确率[5]。丙型肝炎病毒抗体蛋白质芯片检测具有操作简便、样品用量少、结果可量化显示等优点,并具有较高的特异性与敏感性。生物芯片这一新技术,具有较强的扩充整合能力，是未来诊断试剂的发展方向。不足之处在于需要较昂贵的激光扫描仪。对于抗HCV-分片段抗体的检测也有报道使用酶联免疫方法的，分别用HCV-C、HCV-NS3、HCV-NS4、HCV-NS5四种抗原包被酶标板，加入样本后与其结合，再加入辣根过氧化酶标记的鼠抗人IgG二抗酶结合物，底物显色,酶标仪上波长450nm测定A值。用HCV分片段EIA试剂测定待测样品和RIBAHCV3.0确认的样品作比较分析,二者结果基本一致,符合率高[6]。结果都是抗HCV-C、NS3抗体片段阳性率较高,抗NS4、NS5抗体较前两者低。单片段抗原的符合率仍存在一定差异,可能是抗原表达有关,试剂的使用方法不同也是存在误差的原因。在不同区HCV抗体检出率差异较大,可能HCV感染机体后各区抗原产生抗体早晚有关。一般认为HCV-NS3区、HCV-C区出现较早,HCV-NS5区出现晚、HCV-C区抗体持续时间最长。HCV感染机体可诱导明显的细胞免疫和体液免疫应答,因而特异性体液免疫应答可作为机体感染及治疗的指标,这种应答对于结构区及非结构区抗原均可产生。但各种抗原个性有比较大的差异。上述方法检测的抗-HCV抗体为IgG型，抗HCV-IgG只是已感染的标志，不能区分现症感染和既往感染。目前有报道利用银强化滴金免疫技术(SilverenhancedDIGFA)[7]、ELISA和化学发光方法检测抗HCV-IgM抗体的。抗HCV-IgM抗体起病后3～40天可出现。急性期的丙型肝炎患者抗HCV-IgM全部阳性,6个月内转阴者多呈自限性病程,而抗HCV-IgM持续阳性提示病情的慢性化[8]。抗HCV-IgM检测有确诊丙型肝炎病毒感染的意义，可区分病人是否为被动输入抗体,并在病原学诊断、反映病情、判断预后等方面可能有一定作用。由于机体在接受抗原刺激到产生抗体需要一定的时间，这一段时间我们称之为窗口期。在窗口期内，我们无法用检测抗体的方法对HCV早期感染进行诊断。于是出现了检测HCV核心抗原和HCV-RNA的试剂盒。(二)HCV抗原检测１．肝组织中HCV病毒抗原以单克隆抗-HCV-NS3直接酶标法对石蜡包埋肝组织中丙肝炎病毒抗原(HCAg-NS3)进行测定,该抗体系应用基因重组表达丙肝抗原(HCV-NS3区-C33-C)免疫小鼠并通过细胞融合术后获得。具有简便、快速、稳定、特异性和敏感性良好、图象清晰等优点,而且不须特殊仪器设备[8]，但做肝赃穿刺对病人有一定损伤,较难推广。２．血液中HCV核心抗原（HCV-cAg）HCV核心抗原是HCV基因编码的结构蛋白之一,其中21一61位氨基酸区域,是高度保守免疫活性多肤。HCV-cAg是在HCV感染者体内最早出现的血清标志物，几乎与HCV-RNA同时出现[9,10]。目前已有两种检测HCV-cAg的双抗体夹心法ELISA试剂，一种是在抗体产生之前直接检测血清中HCV游离核心抗原[11]，另一种是可以在窗口期和抗体产生后的病毒复制期检测总HCV核心抗原。后者不受检测样品中抗HCV抗体的干扰，检测结果准确可靠，可用于HCV血清学转换前的早期急性丙型肝炎的诊断[12,13]。原因是HCV感染后患者体内产生的抗体可与游离HCV-cAg之间形成抗原抗体复合物，影响其检测的敏感性。而将免疫复合物解离及病毒颗粒裂解后检测总HCV-cAg的方法则克服了这个缺点，大大提高了检测的阳性率[14]。HCV-cAgELISA检测，应用解裂剂解裂HCV免疫复合物，运用单克隆抗体技术建立起来的HCV-cAgELISA法，与HCV抗体检测方法比较，敏感度特异性不比其差，精密度也好，不受一些慢性疾病和自身免疫性疾病的干扰。在感染初期抗-HCV尚未出现之前即可检出HCV-cAg，大大缩短了“窗口期”。其检测方法与HCVRNA的分子生物学技术比较,具有很好的相关性，操作简便易行,敏感性好、特异性高、不需特殊的仪器设备，费用低廉,具有广阔的前景[15]。(三)HCV-RNA检测人在感染HCV后1－２周,血清中即可检测到HCV-RNA。HCV-RNA的存在是HCV在体内活动最直接的指标，有利于HCV感染的早期诊断，对于评价疾病的治疗和预后具有重要意义。HCV-RNA的检测经过竞争PCR，分枝DNA技术等过程，现实验室普遍使用实时荧光定量PCR诊断技术。实时荧光定量PCR是一种较为成熟、稳定的技术。它具有定量准确度高、定量范围宽、特异性较高、步聚简单、自动化程度高、操作快速等优点[16]。该技术按常规PCR方式进行体外基因扩增，在反应体系中，荧光探针能与被扩增片段中