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Western免疫印迹方法做Western免疫印迹时，将膜孵育在稀释的抗体中轻轻摇动并4°C过夜。抗体稀释在含5%的w/vBSA或1XTBS,0.1%Tween-20的脱脂奶粉当中。注意：参考一抗的产品说明书选用合适的抗体稀释液和稀释比例。A．所需溶液和试剂注意：所有溶液用Milli-Q或相当级别的水配制。1.20X磷酸盐缓冲生理盐水(PBS):(#9808)配制1L1XPBS时，取50ml20XPBS用950mlRODI水稀释到1L，混匀。2.1XSDS上样缓冲液：(#7722,#7723)62.5mMTris-HCl(pH6.8，25°C),2%w/vSDS,10%甘油,50mMDTT,0.01%w/v溴酚蓝或酚红。3.转膜缓冲液：25mMTris碱,0.2M甘氨酸,20%甲醇(pH8.5)。4.10XTris缓冲盐水(TBS):配制1L时，称取24.2gTris碱，80gNaCl加入1L水中；调整pH为7.6（稀释至1X使用）。5.脱脂牛奶:(#9999)(重量体积比[w/v])6.封闭液：含5%w/v脱脂奶粉，0.1%Tween-20的1XTBS。配150ml时，在135ml水中兑入15ml10XTBS，混匀；加入7.5g脱脂奶粉，使之溶解；边搅拌边加入0.15mlTween-20(100%)，混匀。7.洗液:1XTBS,0.1%Tween-20(TBS/T)。8.牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin，BSA):(#9998).9.一抗稀释液：含5%w/v脱脂奶粉或BSA，0.1%Tween-20的1XTBS。配20ml时，在18ml水中兑入2ml10XTBS，混匀；加入1gBSA或脱脂奶粉，使之溶解；边搅拌边加入20μlTween-20(100%)，混匀。10.Phototope®-辣根过氧化物酶Western印迹检测体系：(抗兔#7071)(抗鼠#7072)试剂盒中包括生物素标记蛋白分子量标准品(#7727)，标记有辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)的二抗(抗兔#7074)(抗鼠#7076)，抗生物素HRP偶联抗体(#7075)，LumiGLO®化学发光试剂盒(#7003)。11.预染蛋白分子量标准品，宽谱（预混型:(#7720)。12.印迹膜：本套方法在硝酸纤维素膜上优化过，CST推荐使用硝酸纤维素膜。PVDF也可以用本方法。B．蛋白印迹样品制备的通用方法如下所述：1.刺激细胞：加入含调节因子的新鲜培养基处理一定的时间。2.吸去培养基。用PBS清洗一次，吸去洗液。3.加入1XSDS样品缓冲液裂解细胞(6孔板中每孔加100μl，10cm盘中每盘加500μl)4.超声处理10–15秒打断DNA同时降低样品的粘度。5.取20μl样品放在95–100℃加热5分钟，然后放在冰上冷却。6.离心5分钟。7.取20μl加样到SDS-PAGE胶上(10cmx10cm)。注意：CST建议同时加上预染蛋白分子量标准品(#7720,10μl/泳道)以验证转膜成功，还有生物素标记的蛋白分子量标准品(#7727,10μl/泳道)用于判断目的条带分子大小。8.将电泳后的蛋白电转移到硝酸纤维素膜或是PVDF膜上。C.膜封闭和抗体孵育注意：以下所用试剂体积数为10cmx10cm(100cm2)膜的用量。使用不同大小的膜时，根据面积相应调整。Ⅰ.膜封闭1.（可选）转移后，室温下硝酸纤维素膜用25mlTBS清洗两次，每次5分钟。2.将膜孵育在25ml封闭液中，室温1小时。3.用15mlTBS/T清洗3次，每次5分钟。Ⅱ.一抗孵育根据所用一抗，继续以下相应部分的操作。未标记一抗1.将抗体按说明书推荐浓度稀释在10ml一抗稀释液中。把膜孵育在一抗稀释液中4°C过夜并轻轻摇动。2.用15mlTBS/T洗3次，每次5分钟。3.按一抗来源选取合适的HRP偶联的二抗，将膜孵育于封闭剂稀释的二抗中（1：2000），同时加入HRP偶联的抗生物素二抗(#7075)(1:1000)以检测生物素偶联的蛋白质标准品。室温1小时并轻轻摇动。4.用15mlTBS/T洗3次，每次5分钟。5.继续D部分的检测步骤。HRP偶联的一抗1.将抗体按说明书推荐浓度稀释在10ml一抗稀释液中。将膜孵育在一抗稀释液中4°C过夜并轻轻摇动。2.用15mlTBS/T洗3次，每次5分钟。3.用HRP偶联的抗生物素抗体(#7075)检测生物素化的蛋白分子量标准品，HRP偶联的抗生物素抗体按1:1000稀释在10ml封闭液中，室温1小时并轻轻摇动。4.用15mlTBS/T洗3次，每次5分钟。5.继续D部分的检测步骤。生物素标记的一抗1.将抗体按说明书推荐浓度稀释在10ml一抗稀释液中，4°C孵育过夜并轻轻摇动。2.用15mlTBS/T洗3次，每次5分钟。3.将膜孵育在合适浓度的Streptavidin-HRP稀释液中，室温孵育1小时并轻轻摇动。4.用15mlTBS/T洗3次，每次5分钟。5.继续D部分的检测步骤。不需要另加抗生物素HRP偶联抗体(#7075)检测生物素标记蛋白分子量标准品。因为所用的二抗Streptavidin-HRP同样能够使生物素标记的分子量标准品显示出来。D.蛋白检测1.配制10mlLumiGLO®溶液，将0.5ml20XLumiGLO®，0.5ml20XPeroxide兑入9.0mlMilli-Q超纯水。将膜浸入其中，室温下孵育1分钟并轻轻摇动。注意：如果信号出现得太快，可以将LumiGLO®进一步稀释。2.将膜取出并吸走多余的反应底物（但不要使它晾干），包在保鲜膜中然后压上x-光片曝光。第一张胶片的曝光时间为10秒，从胶片上条带的强弱可以判断下一张胶片合适的曝光时间。注意：由于检测反应的动力学特征，在LumiGLO®底物孵育后刚开始的信号是最强的，在随后的2个小时中，信号会不断衰减。