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1《环境微生物的检测与分析》实验指导编者：吴方丽李欧浙江理工大学生命科学学院二零一四年十二月中国浙江杭州2目录实验一土壤微生物拮抗菌的分离与测数.....................................3实验二拮抗菌的鉴定与保藏..............................................14实验三变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析技术及其在微生物种群多样性研究中的应用29附录各种培养基、试剂的配制..............................................393实验一土壤微生物拮抗菌的分离与测数一、实验目的1、熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。2、初步掌握从土壤中分离微生物和测数的基本方法。3、了解培养基的配制原理，掌握其配制过程和方法。4、掌握实验室几种灭菌方法及技术。5、掌握无菌操作技术。6、了解平板菌落计数的原理。7、识别土壤中几大类微生物的菌落特征。8、学习拮抗作用的试验方法，观察微生物间的拮抗现象及抗生素的抗菌作用。二、实验原理自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类的微生物的混合体。为了研究某种微生物的特性或者要大量培养和使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离纯化。在自然界中，土壤是微生物生活的良好环境，各种微生物混居生活在一起。其中生活的微生物的数量和种类极其丰富，因此土壤是人类开发利用微生物资源的重要基地。土壤中微生物的数量、种类与土壤肥力有关，肥沃的土壤中多，贫瘠的土壤中少。其生理类群则与土壤的其它理化性质，如通气性、pH有关。例如在通气良好的菜园土中，好气性微生物占有绝对优势。本实验以肥沃的菜园土为实验材料分离土壤中的好气性细菌、放线菌和霉菌，并进行数量测定。分离微生物常用的方法有：稀释涂平板法、稀释混合平板法、划线分离法等。根据不同的实验材料可以采用不同的分离方法。其最终目的是在培养基上出现欲分离的微生物的单个菌落，必要时再对单菌落进行进一步的分离纯化。本实验分离细菌时采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、分离放线菌时采用高氏一号琼脂培养基、分离霉菌时采用马铃薯蔗糖琼脂培养基。稀释平板计数法是根据微生物在固体培养基上一个活的单细胞繁殖能形成一个菌落这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个活的单细胞。计数时，首先将待4测样品制成一系列稀释液，再取一定稀释度，一定体积的稀释液接种到平板中，使其均匀分布到平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，根据稀释倍数即可计算出样品中的含菌数。由于此方法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。一般用于某些产品检定，如根瘤菌剂等产品的检定，生物制品检验，土壤中可培养微生物含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验等方面。拮抗作用是微生物之间普遍存在的一种相互关系。它是某些微生物生命活动中产生的一种特异性代谢产物─抗生素，具有抑制或杀死另一些微生物的作用。能产生抗生素的微生物称为抗生菌。平板对峙法常用于拮抗菌对离体植物病原菌的拮抗作用的测定。其原理是，把抗生菌与供试病原菌同时置于同一培养基平板上，由于抗生菌对病原菌的拮抗作用，抗生菌菌落边缘与病原菌菌落边缘之间会产生一定的抑菌距离。抑菌距离越大，拮抗作用越强。组织法常用于拮抗菌对活体植物病原菌的拮抗作用的测定，也可用于化合物的活性测定。其原理是把抗生菌所产生的抗菌物质预先接种于即将发病的植物组织上或接种在已发病的植物组织上，由于抗生菌所产生的抗菌物质对病原菌的拮抗作用，病原菌无法致病或延缓病原菌的致病作用。三、实验材料1、器材：电子天平、带有玻璃珠的三角瓶、摇床、1mL的无菌吸管、10mL的刻度试管、无菌水、搪瓷缸、玻璃涂棒、牛角匙、pH试纸、封口膜、记号笔、线绳、纱布、培养皿、高压蒸汽灭菌器、称量纸、药匙、试管架、涂布棒、酒精灯、超净工作台、火柴。2、试剂和材料：无菌牛皮纸袋、无菌铲、标签、打孔器，镊子，牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、75%酒精、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、蒸馏水、新鲜马铃薯、10%酚酞、乳酸。四、实验步骤（一）培养基的配制（1）配制牛肉膏蛋白胨（NA）培养基牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基。5配方如下：牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g琼脂15-20g水1000mLpH7.4-7.61、称量药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入搪瓷缸中。牛肉膏和蛋白胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入搪瓷缸。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2、加热溶解在搪瓷缸中加入少量少于所需的水量，然后放入锅中，在电磁炉上小火加热，并用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则需先调pH值后再溶解琼脂，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失水分。3、调pH用pH试纸或酸碱度计检测培养基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/LNaoH，边加边搅拌，并随时检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol/lHCL进行调节。pH调节通常放在加琼脂之前。注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。4、过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。5、分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。分装量：固体培养基约至试管高度的1/5；分装入三角瓶内的以不超过其容积的一半为宜，半固体培养基以试管高度的1/3为宜。6、加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要适合，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长3/5塞入试管口或瓶口内，以防止棉花脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽、塑料塞或封口膜代替棉塞。7、包扎6加塞后，将三角瓶的棉花外包一层牛皮纸或双层报纸，以防止灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把装同类培养基的试管扎成捆后，再于棉花塞外包一层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。8、灭菌将上述培养基于121摄氏度湿热灭菌30min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。9、摆斜面灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的长度不超过试管总长的1/2；待其凝固，10、无菌检查将灭菌的培养基放入37摄氏度温箱中培养24~48h，无菌生长即可使用。或储存于冰箱或清洁的橱内，备用。（2）、配制高氏一号培养基高氏一号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。配方如下：可溶性淀粉20gKNO31gNaCl0.5gK2HPO40.5gMgSO4·7H2O0.5gFeSO4·7H2O0.01g琼脂20g蒸馏水1000mLpH7.4~7.61、称量和溶解先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入搪瓷缸中，并用少量冷水将其调成糊状，再加少许少量少于所需的水量，放入锅中在电磁炉上边加热边搅拌，至其完全溶解。对微量成分FeSO4·7H2O可先配制成高浓度的储备液后再加入，方法是先在100ml水中加入1g的FeSO4·7H2O，配成0.01mg/ml的储备液，再在1000ml的培养基中加入以上储备液0.1ml即可。待所有的药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。2、pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同上。（3）配制马铃薯蔗糖培养基马铃薯蔗糖培养基是用于分离真菌的选择培养基。配方如下：去皮的马铃薯200g蔗糖20g琼脂20g蒸馏水1000mL，自然pH71、称量和溶解先计算后称量，按用量称取各成分。将去皮的马铃薯切片后放入锅中，然后加少许少于所需的水量在电磁炉上加热20min，然后用双层砂布过滤，滤液重新放入锅中煮沸，然后加入称量好的蔗糖和琼脂，待各成分溶解后，补充水分至所需体积。2、同（2）2（二）制备土壤稀释液（1）取土壤取表层以下5~10cm处的土壤样品，放入灭菌的牛皮纸袋中，用铅笔填写好标签，袋内外各具一张。（2）土壤预处理及保存将采集的样品带回实验室平摊在聚乙烯塑料布上，在室温下阴干，土块捏碎，并检出植物根、茎、叶及石块等杂物，约20号筛筛分。土壤处理好后备用，或放在4摄氏度冰箱暂存。（3）制备土壤稀释液（要无菌操作）1、制备土壤悬液取土样5g，迅速倒入带玻璃珠的45mL无菌三角瓶中（玻璃珠用量以充满瓶底为最好），置摇床中振荡5~10min，使土样充分打散，即成10-1的土壤悬液。2、稀释用无菌移液管吸10-1的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中，震荡混匀即为10-2稀释液，如此重复，可依次制成10-2~10-9的稀释液。注意：操作时移液管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支移液管，每次吸土液，要将移液管插在液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。（三）混菌测定菌落数的方法1、细菌取10-7，10-8，10-9三管稀释液各1ml，分别接入相应标号的平培养皿中，每个稀释度接三个培养皿。然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中（装量以铺满培养皿底的2/3为宜），迅速轻轻摇动培养皿，使菌液与培养基充分混均，但不沾湿培养皿的边缘，待培养基凝固即成细菌平板，倒平板时注意无菌操作。82、放线菌取10-4，10-5，10-6三管稀释液，在每管中加入10%酚液5~6滴，摇匀，静置片刻，然后分别从三管吸出1ml加入相应标号的培养皿中，选用高氏1号培养基，用与细菌相同的方法倒入培养皿中，便可制成放线菌平板。3、霉菌取10-1，10-2，10-3三管稀释液各1ml，分别接入相应的培养皿中，每个稀释度接三个平皿。在溶好的马铃薯蔗糖固体培养基中，每100ml加入灭菌的乳酸1ml，轻轻摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入培养皿中，便可制成霉菌平板。将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即培养皿盖朝下放置，于28~30摄氏度恒温培养，细菌培养1~2d，放线菌培养5~7d，霉菌3~5d。可用于观察菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。（四）稀释倒平板法测定菌落数的方法1、倒平板将牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基和马铃薯蔗糖培养基分别放入微波炉中熔化，将熔化好的培养基冷却至50摄氏度至超净工作台中倒入灭菌好的培养皿中，待冷却后编号备用。2、吸取土壤稀释液用无菌吸管吸取取10-7，10-8，10-9三管土壤稀释液各0.1mL对号接种在不同稀释度编号的牛肉膏蛋白胨培养基平板上。每个编号设3个重复，用于分离细菌。用无菌吸管吸取取10-4，10-5，10-6两管土壤稀释液各0.1mL对号接种在不同稀释度编号的高氏一号培养基平板上。每个编号设3个重复，用于分离放线菌。用无菌吸管吸取取10-1，10-2，10-3两管土壤稀释液各0.1mL对号接种在不同稀释度编号的马铃薯蔗糖培养基平板上。每个编号设3个重复，用于分离霉菌。3、涂布平板用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20~30min使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养。注：无菌操作要点9火焰消毒：在无菌环境中进行培养或进行其它无菌操作时，首先要点燃酒精灯。以后所有的操作，如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都要在火焰附近操作并经过灼烧进行。但要注意：金属器械不能在火焰中灼烧时间过长，以防退火，烧过的金属要待冷却后才能夹取物品，以防造成物品损伤。吸过营养液的吸管不能再次进行灼烧，因残留在吸管中的营养液能被烧焦成碳膜，再用时会把有害物带入培养液中。开启、关闭长有微生物的培养瓶时，火焰灭菌时间要短，防止温度过高烧死细胞。另外，有橡胶