《DNA和蛋白质技术重点例析》

《DNA和蛋白质技术重点例析》张建尚/江苏一、DNA的粗提取与鉴定1．基本原理2．操作过程特别提醒：①本实验不能用哺乳动物成熟红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟红细胞无细胞核。②实验中两次使用蒸馏水，第一次的目的是使成熟的鸡血细胞涨破释放出DNA，第二次的目的是稀释NaCl溶液，使DNA从溶液中析出。③二苯胺试剂要现配现用，否则二苯胺会变成浅蓝色，影响鉴定效果。【例1】下图为“DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作，请仔细观察并分析①～④操作的目的错误的是（）A.①是使鸡血细胞吸水涨破释放出核物质B.②是析出DNA，去除不溶于酒精的杂质C.③是使DNA溶解在2mol/LNaCl溶液中D.④是稀释NaCl溶液使其浓度接近0.14mol·L－1，去除溶于低浓度NaCI溶液的杂质【解析】①是让鸡血细胞在蒸馏水中吸水涨破，以释放出含有DNA的核物质，A项正确；DNA不溶于酒精，而某些蛋白质等杂质溶于酒精，依次可以除去溶于酒精的杂质，B项错误；DNA能够溶解在2mol/LNaCl溶液中，C项正确；④NaCl溶液经蒸馏水稀释使其浓度接近0.14mol·L－1，DNA析出，此时可以去除溶于低浓度NaCI溶液的杂质，D项正确。【答案】B二、PCR技术的基本操作和应用1.PCR技术原料四种脱氧核苷酸除模板、原料、酶以外，PCR至少需要液体环境、PCR仪调控温度和缓冲液三个条件装置PCR仪PCR技术原则碱基互补配对原则原理利用热变性原理使DNA双链间的氢键断裂条件材料的选取：选用DNA含量相对较高的生物组织。破碎细胞去除杂质：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。DNA析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的体积分数为95%的酒精溶液。DNA的鉴定：在溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，沸水中加热5min，溶液变成蓝色。动物：鸡血细胞中加蒸馏水，用玻璃棒搅拌，用纱布过滤，收集滤液。植物：切碎的植物中加入洗涤剂和食盐，进行搅拌和研磨，过滤，收集滤液。DNA在0.14mol/LNaCIDNA不溶DNA被二苯胺溶液中溶解度最低于酒精溶液染成蓝色粗分离进一步提纯鉴定DNA2．PCR反应过程(1)变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链。(2)复性：温度下降到55℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)延伸：温度上升到72℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。3.细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR)的比较细胞内DNA复制体外DNA扩增(PCR)解旋在解旋酶作用下边解旋边复制80～100℃高温解旋，双链完全分开酶DNA解旋酶、DNA聚合酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA、RNA温度体内温和条件高温能量ATP不加循环次数生物体自身控制30多次相同点提供DNA模板；4种脱氧核苷酸为原料；子链延伸的方向都是从5′端到3′端；都需要酶催化特别提醒：①PCR反应过程中的能量来自原料。②PCR反应需要引物，引物的大小要适宜，引物本身不应存在互补序列，引物之间也不应存在互补序列。③在微量离心管中添加各种试剂时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换，确保实验的准确性。④离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢。⑤离心10s的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效果。【例2】多聚酶链式反应(PCR技术)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如图所示。下列关于PCR技术叙述错误的是()A.PCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术B.反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板C.PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增D.应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变【解析】PCR技术是人工合成DNA的方法，原料是脱氧核苷酸而不是核糖核苷酸。【答案】C三、血红蛋白的提取和分离1．方法及原理方法原理凝胶色谱法根据相对分子质量的大小分离蛋白质电泳法各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同2.血红蛋白的提取和分离过程特别提醒：①红细胞洗涤的目的是去除杂蛋白，所用的溶液是生理盐水。②粗分离是用透析法去除样品中的分子量较小的杂质。③纯化是用凝胶色谱法分离相对分子质量不同蛋白质。④纯度鉴定利用的是电泳法。【例3】下图是用除去DNA的滤液进行血红蛋白的提取和分离实验的装置，下列有关叙述错误的是()A.用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较大的杂质B.图乙装置的试管中收集到的液体中最先得到的是相对分子质量较大的蛋白质C.用图乙装置分离血红蛋白时，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每管收集5mL，连续收集D.图丙装置中电泳法分离提纯血红蛋白的原理是血红蛋白带有一定量的电荷，在电场的作用下向一极移动【解析】用图甲装置对滤液进行处理，其目的是除去相对分子质量较小的蛋白质。【答案】A