三七皂甙对阿霉素所致的小鼠骨髓细胞微核的影响(全)

1三七皂甙对阿霉素所致的小鼠骨髓细胞微核率的影响常征（云南师范大学，生命科学院，文山学院，生化系云南文山663000）[摘要]：目的研究三七皂甙对阿霉素诱导的小鼠骨髓细胞微核率的影响。方法将42只小鼠随机分成7个组，每组6只，雌雄各半。阴性对照组（CKn）和阳性对照组（CKp）每天灌胃生理盐水一次，其余5组分别以12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg的剂量每天灌胃PNS一次，所有7个组都连续灌胃7d，最后一次灌胃后CKn腹腔注射生理盐水一次，其余各组以80%LD50的DXR剂量分别腹腔注射一次。给药结束48h后取小鼠骨髓进行微核分析，评价三七皂甙对阿霉素诱导的小鼠骨髓细胞微核率的影响。结果PNS12.5组的微核率显著高于CKn组和显著低于其他各给药组和CKp组（P0.05）；PNS25组和PNS50组的显著高于CKn组、PNS12.5组和显著低于CKp组（P0.05）；PNS100组和PNS200组的微核率虽然和CKp组的没有显著差异（P0.05）。结论低剂量的PNS具有一定的保护染色体不受损伤的作用。[关键词]：三七皂甙；阿霉素；小白鼠；腹腔注射；微核率三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)为五加科(Araliaceae)人参属（Panax）多年生草本植物[1]，别名参三七、山漆、田七等，主产于云南、广西及四川等地。在植物分类上，与人参、西洋参(花旗参)同属于五加科人参属，其体细胞染色体数目为2n=24,核型公式为K(2n)=2x=24=24m，属于“1B”型,全部都属于中部着丝粒染色体,核型为对称型[2]；三七属半阴性多年生的宿根草本植物，是中国特有的名贵中药材，起源于2500万年前第三纪古亚热带山区，由于其对生长环境条件有特殊要求，现仅存于中国西南山区。据有关文献记载，三七使用历史近600年，栽培历史近500年，因其自古以来就被公认为具有显著的活血化瘀、消肿定痛功效而被誉为“金不换”和“南国神草”等。三七主要含有三萜皂甙、三七素、黄酮、挥发油、氨基酸、糖类及各种微量元素等，其中皂苷类是三七主要生理活性成分,含量高达12%[3]，它由三萜皂甙元和糖经糖苷键连接而成的配糖体，它广泛存在于自然界，尤以双子叶植物中分布最多，迄今,已从三七全株中分离到20多种达玛烷型四环三萜皂苷。在植物中，皂甙的主要功能是防御病原体和害虫。然而，最引人注目的是它们具有抗肿瘤、抗病毒、降低胆固醇等多种生物活性，有着相当可观的药用商业价值[4]。现代化学和药理学研究发现三七皂苷(Panaxnotoginosides,PNS)在耐缺氧、抗衰老、提高机体免疫力等方面的药理作用显著优于人参总皂苷,且PNS和部分单体皂苷在血液系统、心脑血管系统、神经系统、物质代谢以及抗炎、抗肿瘤等方面均有较好活性[5]。但在对抗60Coγ射线照射引起的骨髓嗜多染红细胞微核率增加方面作用不显著[6]，而三七皂苷Rg1对环磷酰胺诱导的小鼠骨髓细胞微核发生率和对丝裂霉素诱导的小鼠睾丸染色体畸变均有明显的抑制作用[7]。而对阿霉素所致的小鼠骨髓细胞微核率的影响方面尚未见报道。阿霉素(Doxorubicin,DXR)——也叫亚德里亚霉素，属蒽环类药物，它被用作一种高效、广谱的抗肿瘤药物已有近40年的历史，它对乳腺癌、食道癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨肉瘤、Kaposi肉瘤和软组织肉瘤均有较好的疗效[8]。阿霉素具有抑制DNA合成的能力[9]，还具有引起DNA链断裂的潜能[10,11]；阿霉素的细胞毒性作用可能通过各种各样的机制发生，如自由基的形成[10]、DNA的绑定[12]、拓扑异构酶II的失活[9,13]等等。先前的研究显示，阿霉素能诱导正常细胞和肿瘤细胞发生突变和染色体畸变[9,14,15]。而检测染色体损伤最方便、快速的方法就是小鼠微核试验。微核（micronucleus,简称MN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。在细胞有丝分裂间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。多数学者认为细胞通过两种机制产生微核：一是染色体断裂剂导致染色体断裂，产生无着丝粒断片或环，不能进入子细胞核，被包含在子细胞的胞质内，单独形成一个或几个规则的微核；二是纺锤丝毒性药物能抑制纺锤丝的形成，破坏染色体和纺锤体的连接，阻止细胞分裂中期纺锤丝将染色体拉至细胞的两端，染色单体行动滞后，不能进入子细胞的主核，而形成了一组微核，这样形成的微核体积往往略大于一般典型的微核。由于微核的产生与染色体和DNA损伤有较大关系，故常将微核的检出率作为DNA损伤的一种指标[16]。微核实验2创建于20世纪70年代中期[17,18]，而小鼠微核试验是目前检测化学物质导致染色体损伤方便、快速的方法,是遗传毒理实验常用的细胞遗传学方法之一[19,20]。所以目前许多国家（地区）和国际组织都将其视为评价新药、食品添加剂、农药、化妆品等化合物毒理安全性的必做试验之一[21,22]。本实验也就是采用小鼠骨髓细胞的微核率作为指标来探讨三七皂甙对阿霉素引起的小鼠骨髓细胞微核率的影响。1材料与方法1.1材料与仪器1.1.1实验动物昆明种健康小白鼠[云南实验动物许可证:SCXK(滇2005-0008)]。购于昆明医学院动物试验中心。1.1.2实验药品三七总皂甙，七花有限责任公司（文山），产品批号：20031002；注射用盐酸多柔比星（阿霉素），10mg装，深圳万乐药业有限公司生产，产品批号：0808E1，生产日期：20080823；氯化钠注射液，250ml装，昆明南疆制药有限公司生产，产品批号：B081111h1，生产日期：20081111。1.1.3仪器设备日本奥林巴斯BX51系统荧光显微镜；800型离心机（金坛市大地自动化仪器厂）。1.2实验方法小白鼠42只，体重18~22g，随机分成7个组，每组6只，雌雄各半。阴性对照组（CKn）和阳性对照组（CKp）每天灌胃生理盐水一次，其余5组分别以12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg的剂量每天灌胃PNS一次，所有7个组都连续灌胃7d[26，27]，最后一次灌胃后CKn腹腔注射生理盐水一次，其余各组以80%LD50的DXR剂量分别腹腔注射一次，注射量为0.1~0.2ml/10g体重[23]。给药结束后48h用颈椎脱臼法处死、取样，进行小鼠骨髓细胞微核实验。小鼠骨髓细胞微核实验方法参照了肖福英[16]、MakotoHayashi[21]和汪旭[20,24,25]等的方法，稍加改动。取小鼠股骨，剪去股骨的两端，每条股骨用1ml生理盐水冲洗骨髓腔，每只小鼠用一个离心管。将骨髓冲洗液1000r·min-1离心5min，弃大部分上清液，留少许液体（约0.2ml），轻轻震荡使细胞均匀分散开来。用毛细吸管在每个载玻片上滴两滴，血常规涂片法涂片，自然干燥，甲醇固定10min，晾干，Giemsa原液用磷酸缓冲液（PH6.8）按1∶20的比例稀释，染色20min。自来水轻轻冲去多余染液，充分晾干，中性树胶封片，在油镜下对每只小鼠骨髓细胞分别计数1000个，再分别统计其微核发生率。计数细胞要符合以下条件：①细胞结构完整。即必须有细胞质和细胞核，且细胞质和细胞核对比明显；②细胞核着色鲜明、均匀且边缘相对光滑。③部分被污物或其它细胞组织遮盖的细胞不计数，而如果已经确认是微核细胞则计数。1.3统计学处理半致死剂量实验的LD50计算即采用了Bliss法，同时，还进行了Feiller校正。微核实验结果以平均数±标准差（x±s）表示，微核实验数据用SPSS11.5统计软件进行方差分析，剂量-反应关系进行直线相关分析，计算相关系数。2结果与分析2.1阿霉素对小白鼠经腹腔给药途径的半致死剂量实验经过预实验一和二得到近似的最大致死剂量(Dm)10mg/kg和最小致死剂量(Dn)80mg/kg。在正式实验中按1：0.7的比例，6个组的腹腔给药剂量分别为13.4mg/kg、19.2mg/kg、27.4mg/kg、39.2mg/kg、56mg/kg和80mg/kg，给药后，80mg/kg组所有小鼠约3h即出现中毒症状。中毒的症状包括毛发竖起、蓬松无光泽、行动迟缓、四肢无力、走路蹒跚、食欲减小、眼睛紧闭、颈部皮松散、血管暂时扩张等现象。除最小剂量(13.4mg/kg)外，其他剂量组在7d内均有数量不等的动物死亡，并且死亡率随着阿霉素浓度的增加而递增。存活动物在给药7d后精神、活动、食欲均逐渐恢复正常。通过统计小鼠死亡数量，用bliss算半数致死量的软件计算，得到此次实验的回归方程y(Probit)=-7.6323+9.043Log(D)，经Feiller校正后的小鼠腹腔给药阿霉素的半数致死量为LD50=24.941mg/kg，95%的可信限为21.241~29.271mg/kg，5%死亡率（LD5）的剂量为16.407mg/kg，95%死亡率（LD95）的剂量为37.915mg/kg(详见表1)。表1用Bliss法计算腹腔注射半数致死量（LD50（i.p.）calculatedbyBlissmethod）剂量对数剂量动物数(只)死亡数(只)死亡百分实验机率回归机率3(x)率(%)单位(Y)单位(Y)CK----1000.00--------13.41.12711000.00----2.560119.21.283310110.003.71833.972627.41.437810880.005.84155.369339.21.593310990.006.28176.7758561.74821010100----8.1766801.90311010100----9.57742.2小鼠腹腔注射阿霉素诱发产生微核的最佳时间剂量效应分析实验2.2.1不同剂量阿霉素注射后对小鼠骨髓细胞微核率的影响不同剂量阿霉素注射后小鼠骨髓细胞微核统计结果见表2。通过对剂量与微核发生率的相关性分析（表3，图1），可以看出：阿霉素的腹腔给药剂量与小鼠骨髓细胞的微核发生率有极显著的正相关性（P0.01），即小鼠骨髓细胞的微核发生率随阿霉素的腹腔给药剂量的增大而极显著的增大，它们表现出了极显著的剂量-反应关系。而通过对各给药剂量间微核发生率（‰）均数的两两比较（S-N-K法）（表4）可以看出：所有给药组的微核率都极显著的高于阴性对照组（P0.01），这说明一次染毒就可造成微核率的显著上升。同时还可以看出20%LD50组的微核率极显著的高于10%LD50组（P0.01），40%LD50组的微核率极显著的高于20%LD50组（P0.01），只有80%LD50组与40%LD50组的微核率相比较差异不显著（P＞0.05），但从图1中可以看出，虽然差异不显著，但仍保持了上升的趋势。表2不同剂量、不同取样时间阿霉素对骨髓微核率的影响(‰)组别取样时间18h24h30h48h72hTotalCK2.17±2.142.33±1.213.00±1.792.83±1.471.83±1.172.43±1.5510%LD505.00±3.524.67±3.337.33±1.863.50±0.843.00±0.894.70±2.6920%LD507.33±2.665.83±1.479.33±2.168.33±1.036.17±1.947.40±2.2440%LD505.17±1.608.83±2.7914.67±3.2015.5±3.0210.33±1.5110.90±4.5480%LD5010.00±3.036.50±3.1513.33±4.3219.00±8.0712.00±2.0012.17±6.00Total5.93±3.645.63±3.219.53±5.029.83±7.516.67±4.29-表3给药剂量与微核率的相关性分析MN（‰）DOSEMN（‰）PearsonCorrelation