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-1-实验一小鼠肝组织DNA的提取及鉴定【实验目的】1、掌握动物组织DNA提取的方法；2、掌握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。【实验原理】获得相当纯度和完整性的基因组DNA，可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。因此，DNA样品质量的好坏将直接关系到实验的成败。较理想的DNA样品应达到以下三点要求：①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；③排除RNA分子的污染和干扰。DNA以核蛋白形式存在于细胞中，提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等成分分离，又要保持DNA分子的完整。本实验中，用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）消化破裂细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性沉淀，DNA从核蛋白中游离分开；为控制组织中脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）以除去激动该酶的金属离子，SDS也能使DNase变性失活；蛋白酶K可水解蛋白质，消化DNA酶；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因组DNA。260nm处DNA有最大吸收峰，测DNA的A260，可计算其浓度。而蛋白质在280nm处有最大吸收峰，可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.8~2.0之间。【实验器材和试剂】1、动物小白鼠2、设备移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。3、试剂（1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）：包括BufferCL、BufferPP、BufferGE、RNaseA、ProteinaseK（7）生理盐水，4℃贮存（8）无水乙醇、70%乙醇【操作步骤】1、制备肝匀浆迅速处死小白鼠，称取新鲜肝脏组织50mg，用预冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干后剪碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300μlBufferCL。将肝匀浆液放入EP管，加入1.5μl蛋白酶K，漩涡震荡10s，55℃孵育直到组织溶解（约1小时）。2、提取DNA（1）加入1.5μlRNaseA，颠倒混匀，37℃孵育15-60min。（2）冰上孵育1分钟使样品迅速冷却。（3）加入1/3体积的BufferPP，涡旋震荡20s，12000rpm离心3min。-2-（4）将上清转移到—个新的离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，可见絮状沉淀（纤维状DNA）从溶液中析出。12000rpm离心1min，弃上清。（5）加入300μl70％乙醇，颠倒数次以洗涤DNA沉淀。12000rpm离心1min，弃上清，室温干燥15min。（6）加入50μlBufferGE溶解DNA（如果DNA的量比较大，可以65℃孵育以促进DNA的溶解），室温保存待测。3、DNA浓度和纯度的测定取0.1mlDNA样品，加蒸馏水至1ml，在751紫外分光光度计上测A260值和A280值。计算：DNA浓度（μg/ml）=A260×50×10（请问系数50、10是如何得来的？）DNA纯度=A260nm/A280nm【注意事项】（1）由于DNA主要存在于细胞核内，为便于提取DNA，肝脏的破碎要严格控制好。即要尽可能的将细胞膜破碎，又要尽可能多保留完整的细胞核，以保留60～70％的完整细胞核为宜。为避免DNA过度断裂，不宜用电动研磨器制备匀浆。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提，混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。（2）用氯仿除去组织蛋白，要不断振荡使蛋白质变性。如要得到高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。（3）酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应避免接触皮肤。（4）室温下干燥时尽可能使残留的乙醇挥发掉（DNA中残留的乙醇会影响内切酶的活性或电泳时DNA不下沉），但不要让DNA完全干燥，否则极难溶解，DNA溶解过程通常需要12-24hr。（5）提取过程应尽量保持低温。（6）在波长260nm紫外线下，1OD的光密度值相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为40μg/ml；单链寡核苷酸为20μg/ml。据此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法只用于测定浓度0.25μg/ml的核酸溶液。（7）A260nm/A280nm比值应介于1.8~2.0之间，若比值2表示DNA样品中含有较多的RNA，如比值1.8表明样品中有蛋白质污染。应根据后续实验要求，采取不同的方法纯化。当然也会出现DNA溶液中既含蛋白质又含RNA，其比值介于1.8~2.0的情况，所以有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。【结果】1、A260=，A280=。2、小鼠肝组织中DNA浓度是μg/ml。3、小鼠肝组织中DNA的A260nm/A280nm比值是。【思考题】1、提取和纯化的真核组织DNA有何用途？2、你的A260nm/A280nm比值结果是否介于1.8~2.0之间？有何意义？3、请结合你的实验结果和操作步骤，分析如何检测和保证DNA的质量？-3-实验二聚合酶链反应【实验目的】采用聚合酶链式反应技术扩增小鼠肝组织平滑肌收缩蛋白（SM22α）基因【实验原理】聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）用于体外扩增位于两段已知序列之间的DNA区段（靶序列）。其原理是通过耐热DNA聚合酶催化的DNA合成反应达到对靶序列的扩增。反应中使用两条化学合成的寡核苷酸作为引物，分别与模板DNA两条单链互补，待扩增序列片段位于两条引物之问。PCR扩增包括3个步骤，即变性、退火和延伸。反应需要模板、引物、DNA聚合酶和脱氧核糖三磷酸(dNTP)等的参与。反应混合液被加热以使模板DNA双链变性成为二条单链，随后将反应混合液冷却至引物的熔点温度(Tm)以下，使引物能与靶序列形成杂交双链（退火）。当温度升至72℃左右时，反应体系中的DNA聚合酶按照模板链的序列以碱基互补方式依次把dNTP加至引物的3’端，使互补链从5‘向3’方向不断延伸，直至形成新的DNA双链。通过变性、退火和延伸的一个循环可以使靶序列的分子拷贝数增加一倍。由于每次扩增的产物又作为下一次扩增的模板，因此反应产物的量以指数形式增长，一个分子的模板经过n个循环可得2n个分子拷贝产物。本实验扩增的是小鼠肝组织平滑肌收缩蛋白（SM22α）基因，扩增产物片段大小为541bp。扩增所用的上游引物序列为：5’-AGTTATATTAATTTTGCATAGTGCCTGGTTG-3’，下游引物序列为：5’-GCGCTAGCTACAAGGCTTGGTCGTTTG-3’。【实验器材和试剂】1、设备PCR仪、0.2mlPCR反应管、1.5ml离心管、移液器、吸嘴、旋涡混合器。2、试剂（20μl体系）PCR试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）【操作步骤】1、分别在PCR反应管中加入2×PCRmix10μl、上游和下游引物各2μl、DNA2μl和H2O4μl。2、把PCR反应管放人PCR仪，按仪器操作要求启动扩增程序。本实验的扩增程序为：94℃预变性5分钟后进入循环扩增，即94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min。重复35个循环后，于72℃再延伸10min，最后4℃保温。3、反应结束后，将PCR反应管于12000rpm离心15s，取扩增产物进行电泳分析。【注意事项】1、由于PCR技术的灵敏度高，极微量的污染也会造成扩增的假阳性结果。因此，必须采取相应措施避免发生污染。2、PCR实验应设立阴性对照反应，即在反应体系中不加模板DNA。3、多份样品同时扩增时，可配制总的反应混合液，并分装于PCR管中，然后再在各管中分别加入模板。4、临床诊断用PCR反应必须在专门的PCR实验室中进行，实验室应包括试剂配制室、模板制备室、PCR扩增室和产物检测室等功能区。PCR实验中的各个步骤应在相应的功能区中进行。5、PCR试剂与模板DNA及样品应分别保存于不同功能区的冰箱中。6、操作时应戴手套，配制反应体系和加模板时应分别使用专用的移液器，所有耗材使-4-用前必须经高压灭菌，用后按规定处理并丢弃在指定容器中。【结果】【思考题】1、PCR各组分在反应中的作用是什么？2、降低退火温度、延长变性时间会对反应有何影响？-5-实验三琼脂糖凝胶电泳【实验目的】掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。【实验原理】带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用技术。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，及构型不同的DNA分子。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。荧光染料溴化乙锭(EB)能插入DNA分子中形成复合物，紫外光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量。由于EB是致癌剂，现在开发出了安全的染料，如SyberGreen、GelRed、GoldView等。【仪器与试剂】1.仪器天平、锥形瓶、微波炉（或电炉）、制胶板、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像分析仪（或紫外线透射仪）、微量可调移液器、移液管、量筒、一次性塑料手套。2.试剂（1）50×TAE电泳缓冲液：Tris碱242.0g、冰乙酸57.1ml、EDTA63.5g、NaOH10.0g，加蒸馏水至1000ml，使用前用蒸馏水稀释至1×TAE电泳缓冲液。（2）6×loadingbuffer：(0.25％溴酚蓝，0.25%二甲苯氰FF，30%甘油水溶液)或（0.25％溴酚蓝，40％(w/v)蔗糖水溶液），贮存于4℃。（3）电泳级琼脂糖（Agarose）、溴化乙锭（母液:将EB配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可）、DNAMarker、DNA、蒸馏水。【实验步骤】1．配制1.5％的琼脂糖凝胶：精确称取1.5g电泳级琼脂糖，加入100ml1×TAE电泳缓冲液，在微波炉里（或电炉）加热使琼脂糖颗粒完全溶解（加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发），待胶冷却至55ºC左右时，加入20µl溴化乙锭（也可先不加EB，而是电泳后再用0.5µg/ml的EB溶液浸泡染色），轻轻旋转混匀。插入合适的梳子，将溶液倒入制胶板中，待凝结后拔去梳子待用。2.加样：将凝胶置于电泳槽，加入1×TAE电泳缓冲液覆盖胶面即可。各取PCR产物和DNA-6-分子量参照物10µlDNA加入1µl6×loadingbuffer，混合后上样，分别加入琼脂糖凝胶孔内。加样时切勿破坏点样孔周围的凝胶。3.电泳：合上电泳槽盖，打开电泳仪，控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。4.染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中，室温下染色20-25分钟。5.观察和拍照：电泳完成后切断电源，取出凝胶，置于凝胶成像分析仪上观察电泳结果，并照相记录。或在波长为254nm的紫外灯下观察DNA的荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。【注意事项】1．影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：（1）DNA大小：迁移速率与logN成反比（N为碱基对数目）。分子越大，迁移越慢。分子量相同的空间结构越紧密的电泳越快，如超螺旋线性DNA。（2）琼