《微生物学及实验》实验指导书

《微生物学及实验》实验指导书第一部分实验目的《微生物学及实验》实验课是我院环境科学专业学生必修的一门重要的基础实验课，是学生进入我院实验室的第一门实验课。《微生物学及实验》实验的目的是使学生掌握微生物学的基本实验方法和技术，正确的使用实验的仪器设备，在学生头脑中建立无菌概念和掌握无菌操作技能是最重要的内容，是学生进行后续课实验和研究的基础。在目前的实验室条件和有限学时的情况下，得到微生物实验技术的基本操作和技能训练，培养学生动手操作能力和创新能力。通过微生物学实验课教学，加深理解和巩固课堂所学的知识，熟悉微生物学实验的基本操作技术，了解微生物实验的基础知识。通过微生物学实验培养学生观察、思考、分析问题、解决问题的能力，养成实事求是、严肃认真的科学态度、创新精神、创新思维和创新能力。本实验指导书主要内容包括：微生物个体和菌落形态观察、染色方法、培养基制备和灭菌、无菌操作、微生物检测和分离、生理生化反应、影响微生物生长的因素和污染物微生物降解实验，水中微生物分布调查等内容。同时也注意和环境微生物学的联系与区别。整个实验课中贯穿了显微镜使用—灭菌方法—无菌操作—微生物菌种分离筛选鉴定、选育—微生物代谢作用这一主线。微生物学需掌握的基本操作在实验中得到训练，同时加深了学生对所学微生物学基本概念的理解。实验设计贴近生活，可以大大提高同学们学习微生物学的兴趣。实验内容与目录如下：序号实验名称学时实验类型实验一光学显微镜的使用及活性污泥中生物相的观察3基础验证实验实验二微生物的染色及观察3实验三培养基的制备和灭菌3实验四纯种微生物的分离、转种和培养3实验五有机污染物质的生物降解实验*4综合性实验实验六双歧杆菌口服液的发酵制备*4*注：实验六为选做实验。第二部分微生物学实验室规则微生物学实验的对象大多为环境微生物，其中某些微生物对人体具有危害性，因此要求进入实验室后必须严格遵守以下实验室规则：1.进入实验室应先穿白大衣，离开实验室时要脱下白大衣，反折放回原处，不必要的物品不得带入实验室，必须带入的书籍和文具等应放在指定的非操作区，以免受到污染。无菌操作时必须戴口罩，并不得开电风扇。2．进入实验室进行实验前应先洗手，避免手上的分秘物、食物油、护肤用品和沾染的微生物等对实验造成污染。3．实验室内禁止饮食、抽烟，不得高声说笑或乱走乱串。4．各种实验物品应按指定地点存放，用过的器材必须经消毒处理，禁止随意放置。5．须送恒温生化培养箱培养的物品，应做好标记（标明姓名、编号、日期、培养时间）后送到指定地点。6．实验过程中如发生意外事故时，禁止隐瞒或自作主张不按规定处理，应立即报告老师进行正确的处理。如有传染性、腐蚀性的材料污染桌面、地面等，应立即用0.2%-0.5%“84”消毒液浸泡污染部位，作用5～10min后方可抹去。如手被活菌污染也应使用上述消毒液浸泡5～10min或肥皂清洗后，再以自来水反复冲洗干净，必要时去医院就医。7．爱护室内仪器设备，严格按操作规则使用。节约使用实验材料，不慎损坏了器材等，应主动报告老师进行处理。8．实验完毕，应物归原处、将台面整理清洁，将实验室打扫干净。最后以肥皂洗手后方可离开实验室。第三部分实验内容实验一光学显微镜的使用及活性污泥中生物相的观察实验项目性质：基础验证实验所属课程名称：《微生物学及实验》实验计划学时：3学时一、实验目的1.学习并掌握显微镜的原理和使用方法。2.复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。3.观察几种真核微生物的个体形态，掌握生物图的绘制方法。二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜，它们由机械装置和光学系统两大部分组成。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间滴加镜油，这主要有如下二方面的原因：1.增加照明亮度油镜的放大倍数可达100×，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的油镜（通常用香柏油，其折射率n=1.52）。2.增加显微镜的分辨率显微镜的分辨率或分辨力是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，分辨力D可表示为：D=λ/2NA，式中λ=光波波长；NA=物镜的数值孔径值。光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0.4-0.7mm），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为：NA=n×sinα式中α为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最大只能达到1200，而n为介质折射率。由于香柏油的折射率（1.52）比空气及水的折射率（分别为1.0和1.33）要高，因此以香柏油作为镜头于玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值（NA一般在1.2-1.4）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（NA都低于1.0）。若以可见光的平均波长0.55mm来计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4mm的物体，而油镜的分辨率却可达到0.2mm左右。利用显微镜的放大原理观察视野中的各种生物，根据观察到的生物形态、运动方式、生物（细胞）结构初步判断所观察到的生物的种类。三、实验器材1.菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）染色玻片标本、青霉（Penicilliumsp.）的水封片等（教师可根据具体情况选用菌种）、活性污泥混合液。2.溶液或试剂：香柏油、乙醇：乙醚混合液3.仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等。四、操作步骤1.观察前的准备（1）显微镜的安置：置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约3-4cm。镜检时姿势要端正。取放显微镜时应一手握住镜臂，一手托住底座，使显微镜保持直立、平稳。切忌用单手拎提；且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录。（2）光源调节：安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。（3）根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有曲光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。（4）聚光器数值孔径值的调节：调节聚光器虹彩光圈值与物镜的数值孔径值相符或略低。有些显微镜的聚光器只标有最大数值孔径值，而没有具体的光圈数刻度。使用这种显微镜时可在样品聚焦后取下一目镜，从镜筒中一边看着视野，一边缩放光圈，调整光圈的边缘与物镜边缘黑圈相切或略小于其边缘。因为各物镜的数值孔径值不同，所以每转换一次物镜都应进行这种调节。在聚光器的数值孔径值确定后，若需改变光照强度，可通过升降聚光器或改变光源的亮度来实现，原则上不应再通过虹彩光圈调节。当然，有关虹彩光圈、聚光器高度及照明光源强度的使用原则也不是固定不变的，只要能获得良好的观察效果，有时也可根据不同的具体情况灵活运用，不一定拘泥不变。2.显微观察在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。低倍镜观察：金黄色葡萄球菌染色标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。下降10×物镜，使其接近标本，用粗调节器慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用细调节器调节至图像清晰。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。在任何时候使用粗调节器聚焦物像时，必需养成先从侧面注视小心调节物镜靠近标本，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本进行准焦的习惯，以免因一时的误操作而损坏镜头及玻片。高倍镜观察：低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦(parfocal)。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。油镜观察：高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径值超过1.0，还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香柏油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。有时按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因油镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况，应重新操作。另外应特别注意不要因在下降镜头时用力过猛，或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。（4）活性污泥观察取一片干净的载玻片放在实验台上，用一支滴管吸取试管中藻类培养液于载玻片的中央，用干净的盖玻片覆盖在液滴上(注意不要有气泡)即成标本片。用低倍镜和高倍镜观察。3.显微镜用毕后的处理（1）上升镜筒，取下载玻片。（2）用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸取少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。（3）用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。（4）将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。五、实验报告1.分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌及青霉的形态，包括在三种情况下视野中的变化。同时注明物镜放大倍数和总放大率。2.绘出活性污泥生物相观察中和各种微生物和菌胶团。六、思考题1、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？2、试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？3、什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？4、影响显微镜分辨率的因素有哪些？5、根据实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小，选择不同的物镜进行有效的观察。6、根据你观察到的活性污泥中的微生物种类，说明水质污泥情况。实验二微生物的染色及观察实验项目性质：基础验证实验所属课程名称：《微生物学及实验》实验计划学时：3学时一、细菌的简单染色法1实验目的1.1学习微生物涂片、染色的基本技术。1.2掌握细菌的简单染色法。1.3初步认识细菌的形态特征，巩固学习油镜的使用方法和无菌操作技术。2实验原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染