三种不同因子对三角帆蚌外套膜细胞Ca2流动性的影响

1三种不同因子对三角帆蚌外套膜细胞Ca2+流动性的影响施志仪*郝莹莹李文娟韩健靳雨丽（上海海洋大学农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室，上海201306）关键词三角帆蚌；外套膜细胞；非损伤微测；Ca2+流动性三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)是我国主要的育珠母蚌，其所培育出的珍珠色泽鲜艳、细腻光滑，因而成为目前淡水育珠生产中首选的育珠母蚌之一。蚌的外套膜是贝壳和珍珠形成的重要组织器官，有内外两层表皮细胞及其间的结缔组织构成。它对钙具有高度通透性[1~3]，其上皮细胞具有通过细胞膜主动吸收Ca2+和贮存Ca2+的功能[4]，并通过胞吐作用排出钙至外套膜外腔中，这些钙就是形成珍珠的基础。维生素D3可促进Ca2+的吸收和增加钙的运转，对钙吸收起着重要作用[5]。对贝类的研究表明，适量维生素D3能够促进矿物质在贝壳中的沉积[6]。而促进贝壳和珍珠很好的生长的一个不容忽视的因素是环境中的钙浓度[7~9]，水体环境Ca2+升高，可增加外套膜组织Ca2+浓度[10]。研究表明，60~80mg/L的Ca2+浓度最有利于促进三角帆蚌珍珠质沉积[11]。此外，温度对外套膜细胞的珍珠质的沉积也有影响[12]，温度过高或过低都会影响珍珠质分泌，甚至造成蚌体死亡。非损伤微电极测定技术(Non-invasivemicro-testtechnology，NMT)在细胞和组织水平进行功能鉴定、跨膜生物信息传递机制研究等方面发挥了重要的作用[13]。国内外已经有许多研究者运用NMT对生物Ca2+流动进行了研究。本研究运用NMT在不同浓度Ca2+、维生素D3以及不同温度的培养条件下，研究三角帆蚌外套膜细胞外的Ca2+的流动特性，以期为三角帆蚌Ca2+代谢的分子调控机制的研究提供资料，也为日后提高珍珠培育产量提供理论基础。本试验采用2龄的活力较强的三角帆蚌，蚌体大小(长宽高为11×8×3cm)，由浙江诸暨养殖基地提供，育珠蚌在小型玻璃水族缸(40×30×20cm)中暂养，所用的都是曝气的自来水，调节其含钙量约为1.25mmol/L。本试验所用试剂和仪器有：维生素D3(上海生工)，二甲基亚砜(DMSO)(天根生化科技)，RPML1640培养基、抗生素(青霉素、链霉素各10000U/ml)、优级胎牛血清(上海博升生物)，胰蛋白酶、EDTA（Gibco公司)，全培养基(RPML1640+20%胎牛血清+200U/ml双抗[14])，0.25%的胰酶(含有0.02%EDTA)，VD3孵育液用二甲基亚砜溶解为40000U/L的储液，Ca2+孵育液用无水CaCl2配成为0.5mol/L的储液，测试液使用无Ca2+Hanks(C0218，碧云天)配成。恒温细胞培养箱(REVCO，美国)，倒置显微镜(Olympus，日本)，非损伤微电极测定(BI0-001系列，美国扬格公司)，超净工作台中(苏州净化设备厂)。外套膜组织细胞的培养：取3只蚌用手术刀切开蚌的闭壳肌，用无菌蒸馏水反复冲洗外套膜，采用撕裂法分离出外套膜外表皮[15]，再浸入双蒸水配制的0.01%高锰酸钾溶液中30min收稿日期：2010-07-25接受日期：2010-09-02本研究由上海市博士后科研资助计划面上项目(No.09R21413200)，上海市科委基础重大项目(No.06aj14003)和上海市重点学科水生生物学建设(No.S30701)资助项目通讯作者。Tel:[phone],E-mail:[e-mail]2进行初步消毒。然后依次用含有3个浓度梯度的双抗(青霉素+链霉素)的PBS冲洗，3个浓度梯度依次为：不添加双抗的PBS；含有200U/ml双抗的PBS；含1000U/ml双抗的PBS。然后将外套膜外表皮组织剪成1mm2的小片，浸于0.5ml的0.25%的胰酶(含有0.02%EDTA)中37℃消化30min，再用2ml含有胎牛血清的培养基终止胰酶消化细胞，然后将液体吸出，用PBS清洗组织块，将组织细胞贴于培养皿中，在26℃恒温培养箱中倒置培养4小时后再正置，添加2ml全培养基继续培养，共培养组织15份(15个培养皿)。培养24小时稳定后再进行孵育测定。培养的组织被分成3组，其中，第1组9个培养皿采用Ca2+终浓度为0.5mmol/L、1.25mmol/L、3mmol/L测试液分别孵育9个培养皿的组织，即3个浓度，每个浓度3个培养皿组(生物学重复)，30min稳定后进行细胞外Ca2+流动研究[16]。由于NMT测试中，测试液必须含有所要测试的离子，因此，Ca2+测试组中Ca2+浓度不能为0mmol/L；第2组3个培养皿采用瞬时添加的方法用VD3储液(40000U/L)将细胞外测试液VD3分别调节为终浓度0U/L、50U/L、100U/L、500U/L，进行细胞外同一位点的Ca2+流动研究(溶液中调节Ca2+浓度为1.25mmol/L)；第3组采用自动控温装置分别在细胞外同一位点的20℃、26℃、30℃检测Ca2+的流动(每组都有3个重复样，每个样测定6个位点)。实验过程为：首先将24小时后培养稳定的组织细胞中培养基吸出，用无钙Hanks先轻轻润洗组织2遍，然后置于Hanks(其调至添加了我们所需的每组不同的钙离子的浓度)中培养30min，待细胞在测定过程中能保持稳定的生物状态，测定Ca2+流动速度与方向。其中Ca2+组采用调至Hanks中Ca2+终浓度为0.5mmol/L、1.25mmol/L、3mmol/L分别孵育9个培养皿即3个浓度，每个浓度3个培养皿组(生物学重复)30min；VD3组则采用从低浓度开始添加，根据加入后的液体体积再计算第二浓度的添加量，由于液体体积变化很小，对浓度影响不大，如添加维生素D3终浓度为50U/L时，测试液是198µl，按浓度计算应添加0.25µl的孵育液，依次类推。每测定一个浓度需5min，观察其Ca2+流动变化，待稳定后记录数据。细胞外Ca2+的测定：非损伤微测技术是利用一种灌有液体离子交换剂的微电极在细胞周边进行测定，Ca2+选择性微电极在接近细胞与远离细胞的两点间(间距30µm)往返移动(图1)。在已知距离dx进行两点测定，获得两个电压V1和V2，算出两点的浓度差，最终数据通过Fick第一扩散定律公式计算出Ca2+移动速率，数据表现形式为pmol·cm-2·s-1，即每秒通过1平方厘米的该离子/分子摩尔数(其中，流速为正值表明Ca2+外排，负值表明Ca2+内流)。样品测定持续时间为5min，测试液除了进行20℃和30℃测定时，均为26℃。Fig.1Cellsweremonitoredbynon-invasivemicro-testtechnology数据处理：所有数据采用SAS软件GLM程序的单因子方差分析(SAS6.12，1996)，数值表示为均值和SE，不同组间显著性分析采用Duncan多重比较及t-test，显著差异为P0.05，极显著差异为P0.01。3组织细胞培养结果培养24小时后稳定的外套膜组织细胞在倒置显微镜下观察发现(图2)，培养稳定后组织周围有许多散落的细胞与细胞群，多个细胞群形成一个生长晕，生长晕的细胞之间排列紧密，远离组织周围的游离细胞个体很大，排列稀疏，细胞呈圆形，直径大小在11.29±0.2µm，在高倍镜下可见细胞中有颜色较深的颗粒状物质。Fig.2Observedtissuesandcellsunderinvertedmicroscopeafterstableculture(100×)添加不同Ca2+浓度对胞外Ca2+流动性的影响Fig.3ThechangeoftheaveragerateofCa2+outofmantlemovementafteraddingCa2+withdifferentconcentrationsThesameletterexpressesnosignificantdifference(P0.05);differentlettersexpressverysignificantlydifference(P0.01).水体Ca2+的浓度对外套膜细胞胞外Ca2+流动有显著的影响(P0.05)。如图3所示，随着孵育液中Ca2+浓度增大，外套膜外的Ca2+外排速度减小，Ca2+运动方向也由外排变为内流。当Ca2+浓度增大时，去极化电位增大，电压依赖性钙通道打开，膜电压也发生了改变，引起Ca2+的大量内流[17]。本研究数据显示，在添加Ca2+浓度为0.5mmol/L时，细胞处于Ca2+外排状态，平均流速为190.8±6.9pmol·cm-2·s-1；当Ca2+浓度增大为1.25mmol/L时，细胞仍处于Ca2+外排状态，平均流速为171.2±10.6pmol·cm-2·s-1，Ca2+外排速度变小，相对0.5mmol/L组Ca2+运动变化差异不显著(P0.05)；当Ca2+浓度添加至3mmol/L时，Ca2+内流加大，即Ca2+运动方向由外排转变为内流，平均流速为108.3±27.4pmol·cm-2·s-1，流速与0.5mmol/L和1.25mmol/L组4间存在极显著差异(P0.01)。唐敏等[18]在活体研究中也表明：较高的环境钙浓度有利于三角帆蚌组织对钙的吸收和贮藏。添加不同VD3浓度对胞外Ca2+流动性的影响Fig.4ThechangeoftheaveragerateofCa2+fluxafteraddingvitaminD3withdifferentconcentrationsThesameletterexpressesnosignificantdifference(P0.05);differentlettersexpressverysignificantlydifference(P0.01).采用NMT技术对培养30min稳定后的细胞进行测定，测定过程中在测定液里瞬时添加不同浓度的维生素D3孵育液，结果表明：胞外Ca2+流动与膜外电压一致，同样以振荡式变化；随着维生素D3浓度的增加，细胞外的Ca2+的运动方向由外排逐渐变为内流，内流速度越来越大(图4)。这与丛玉艳等[19]的研究一致，维生素D3通过加速对钙的吸收，进而促进钙的沉积。本试验结果数据分析表明，当测试液中不添加维生素D3时，细胞主要处于Ca2+外排状态；当添加浓度为50U/L时细胞仍处于Ca2+的外排状态，与对照组相比差异不显著(P0.05)；当添加浓度达到100U/L时细胞外Ca2+运动方向开始转变为内流，与对照组和50U/L组有显著差异(P0.05)，并且达到极显著水平(P0.01)；当添加的浓度增大到500U/L后细胞外Ca2+的内流平均流速增大，与其它组间均存在极显著差异(P0.01)。外套膜表皮细胞对维生素D3及其代谢产物都很敏感，把此甾体激素注射到外套膜溶液中后，钙大量地被吸收[20]，因此认为维生素D3可以刺激通道蛋白的通透性增大，大量的Ca2+可以流入细胞内。温度对Ca2+流动性的影响5Fig.5InfluenceoftemperatureontheaveragerateofCa2+outofmantlemovement孵育液的温度对外套膜细胞外Ca2+流动的影响如图5所示，胞外Ca2+流动以振荡式有规律的变化：温度在20℃时，细胞膜外Ca2+总体上表现为微量外排，平均速度为12.8±9.5pmol·cm-2·s-1；温度从20℃升到26℃时，细胞外Ca2+运动方向是由微量外排逐步变为内流，且内流速度变大：26℃时平均速度为-237.1±8.5pmol·cm-2·s-1；温度逐步升至30℃时，膜外Ca2+流动方向发生了显著变化(从内流逐步变为外排，P0.05)，且Ca2+外排速率增大，平均速度为262.3±8.2pmol·cm-2·s-1。三角帆蚌的最适生长温度为20℃~30℃，而23℃~30℃的水温范围则是育珠蚌分泌珍珠质的较适温度[20]，其中26℃是三角帆蚌培育珍珠的最佳温度[21]。与本研究结果一致，大量的Ca2+流入蚌体内，加快Ca