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1《分子医学实验学》实验指导供口腔、护理、药学各专业用（第一版）佛山科学技术学院医学院编2008年6月2编写说明《分子医学实验学》是一门集生物化学、免疫学、生物化学技术和分子生物学基本实验、科研探索和医学应用于一体的全新的综合性实验课程。其实验技术反映现代生物医学发展趋势。《分子医学实验》是基础医学实验教学的重要组成部分，是医学各本科专业的专业基础必修课。课程内容包括分子医学基本实验技术、基础实验及综合和设计性实验等部分。课程的主要目的一是强化基础知识教育，突出基本技能训练，是使学生能掌握分子医学的经典理论和基本实验，二是培养学生综合性素质，开发学生的科研潜能和创新思维。开设分子医学实验学的目的在于：1、验证和巩固理论知识，加深对理论知识的全面理解，加强记忆。2、通过实验，掌握分子医学实验学的基本操作技术，掌握层析法,电泳法,分光光度法和生物大分子制备等常用的实验方法的基本原理，熟悉分子医学实验的一般知识。3、培养学生观察、比较、思考及分析问题和解决问题的能力，使学生具备一定的动手操作能力、创新能力培养学生科学、严谨、认真工作态度及理论联系实际、实事求是的工作作风。本实验指导11个实验项目涵盖了分子医学实验学中沉淀、离心、层析、电泳、分光光度测定等分子医学实验的基本方法，可依实验所需时间作合理组合实验，根据实验条件和教学安排适时开课。3实验室规则1．实验前必须预习实验指导和相关理论知识，明确实验目的、原理、预期的实验结果、操作关键步骤及注意事项，计划安排实验工作时间。2．穿白大衣准时进入实验室，保持实验室整洁安静，不得谈笑和大声说话，不准做与实验无关的事情。3．实验时应持“三严”作风——态度严谨、思维严密、操作严格。实验中认真、仔细观察实验过程中的实验现象和结果，及时如实的做好原始记录。实验失败须重做。根据实验结果进行科学分析，写好实验报告，交指导教师批阅。4．注意安全，不得擅自离开。使用易燃、易爆、有毒试剂和材料进行实验时，应严格遵守操作规程，防止火灾、中毒、污染、触电等事故发生，一旦发生，果断处理并立即报告教师5．爱护公物，防止损坏，若有损坏及时报告原因并登记。公用仪器就原处使用，了解使用方法及遵守操作规程，使用后必须在仪器登记本上登记并签名。公用试剂就近量取、用毕随时放回原处。要节约水、电、煤气及试剂药品6．实验结束，洗净器材，清整实验室，打扫卫生，检查门、窗、水、电和煤气的安全。4目录实验一实验室基本知识和技术（5）实验二蛋白质浓度测定（双缩脲法）（21）实验三醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质（23）附：电泳技术（27）实验四血浆清蛋白的分离纯化与鉴定（35）附：层析技术（37）实验五胰岛素及肾上腺素对血糖浓度的影响（45）实验六脱氧核糖核酸（DNA）的提取及成分鉴定（48）实验七质粒DNA提取与纯化（51）实验八DNA重组质粒的设计与构建（54）实验九凝集试验（61）实验十肝功能组合实验（65）附1：血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定附2：酶联免疫吸附试验（ELISA）实验十一免疫血清的制备（71）5实验一实验室基本知识和技术（Thebasicknowledgeandtechnologyoflab）【目的和要求】1．掌握各种基本的生化技术、常用仪器的分类、使用及注意事项2．熟悉生化实验室规则3．清点洗刷实验用具。【实验内容】1．实验室规则2．生物化学实验各种基本技术3．722型分光光度计的使用4．实验记录和实验报告【仪器、设备】1.烧杯2.试管3.刻度吸量管4.离心管5.滴管6.搅棒7.枪式移液器及其配适吸头8.混匀器9.恒温水浴箱10.离心机11．722型分光光度计，721型分光光度计第一部分基本知识与操作一、常用的玻璃仪器（一）分类：常用的玻璃仪器分类有量器和容器，“量器”主要包括：量筒、量杯、容量瓶、吸管等。“容器”主要有烧瓶、烧杯、试管、试剂瓶、离心管等。量器有量入式和量出式两种形式。“量入式”用“ＴＣ”、“Ｅ”、“λ”表示，定量标记由下往上递增，测量注入量器中的液体；“量出式”用“TD”、“A”表示；定量标记由上而下递增；测量从量器中倾出的液体。（二）玻璃仪器的洗涤、干燥1、洗涤液：①洗洁精，肥皂水，洗衣粉。②玻璃仪器专用洗涤液：主要成份为中性稀氯氧化剂，上海日化研究所出品2、洗涤的要求与步骤：要求：洁净的玻璃器皿表面应不挂任何水滴。步骤：不净的器皿洗衣粉或肥皂水刷洗6自来水冲净达到要求？是浸入洗液(数小时至过夜)自来水冲净蒸馏水涮洗2—3次(其目的是去除自来水中的杂质，故应少量多次，全面充分)烤干或晾干、备用注意：对使用过的仪器应养成及时清洗的习惯，特别是血液分析时用以吸取血液样本的吸管，用过后应当立即用水将所沾的血液冲去，否则放置过久，血液干燥硬结，就很不容易清除。①新购置的玻仪：合成洗涤剂洗刷→→0.2mol/L盐酸浸泡（去除游离碱）２―６小时→→自来水冲洗→→ＤＳ冲洗２――３次。②一般容器：如试管、烧杯、三角烧瓶等。流水冲洗→→合成洗涤剂洗刷→→自来水多次冲洗→→ＤＳ冲洗。③容量分析仪器：如吸管、容量瓶、量筒、滴定管等。使用后立即浸泡水中。自来水多次冲洗→→沥干→→铬酸洗液浸泡数小时→→自来水多次冲洗→→ＤＳ冲洗２――３次。（不能刷洗）④比色杯：用毕立即用ＤＳ反复冲洗。洗不净时，用盐酸冲洗，再用自来水冲洗和蒸馏水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗，切忌用试管刷或粗糙纸试擦3、玻璃仪器的干燥一般的玻璃仪器均可洗净后倒置架上，让其水分蒸发自然干燥，如需迅速干燥者应按仪器的不同类型按下述不同方法处理：①试管、离心管、烧杯、烧瓶等普通玻璃器皿可置烤箱中100—105℃烘烤②少量仪器如需急用也可在电炉上或酒精灯上烘烤。烘烤时应将器皿时时转动，务使受热缓慢且均匀，并将管口(或杯口)倾斜向下，以便水蒸气冷凝成水滴，顺口流出，不致使水滴接触烘热了的器壁而使仪器爆裂。③使用电吹风干燥一般玻璃仪器也很便利常用。④下列玻璃仪器应避免烘烤：各种计量玻仪：不可烘烤，自然干燥（容易造成器壁变形而致容量不准）。常用定量吸管很难自然干燥，可在８０至１００℃烘箱烤干。厚壁玻仪（研钵、量筒比色杯：等）及结构复查的玻仪：易在烘烤时发生破裂，不可烘烤，自然干燥。（自然干燥适应于不急于使用和各种计量玻仪；烘烤干燥除结构复杂、厚壁及计量玻仪外，均可。温度在１２０℃，刻度吸管温度应小于１００℃。）二、常规操作技术及注意（一）移液操作用于移液操作的有奥氏吸管、移液管、刻度吸管三种吸量管及枪式移液器。三种吸量管比较奥氏吸管移液管刻度吸管特点管中有一球形膨起管中有棱形膨出直筒状7只有一个刻度只有一个刻度有多个刻度准确度最高次之再次之应用适用于吸取标准液吸取标准液生化实验中广泛使用或粘稠性血标本管尖液吹不吹吹（完全流出式）停留15秒不吹（不完全流出式）流速愈慢愈好慢流出快流出1、吸量管的使用①吸量管的选择：·在一次完成转移的前提下，应选用容量较小的吸量管·对于同一次实验中同一种试剂的移取，应选用同一支吸量管②操作(见图1—1)·用洗耳球将液体吸至超过标线·移开洗耳球，迅速用食指压紧管口·必要时将管尖端外围拭净·调液面至标线·放开食指，使液体流入容器·将最后液滴沿器壁而下或吹出③读数(见图1—2)·吸量管保持垂直·视线与液面应水平·管中液面与刻度线应呈切线使用注意：持管方式；管尖插入液面的深度；吸液；读数（认刻度，准确读数，注意无色液与有色液读数之区别）；放液（吹与不吹之分，注：对于刻度由上至下的吸量管应尽量使用上端刻度管尖残液是否需吹出，看清标记）。2、枪式定量移液器的使用①抢式移液器的结构(见图3)（1.液体吸放钮2．体积选取钮3.体积、显示4．枪头排放钮5.枪头排放器6．枪头接嘴）其内部柱塞分2段行程，第1档为吸液，第2档为放液，手感十分清楚。种类：固定式和可调式规格：0.5――10000ul不等8②操作(见图1—4)·正式使用之前，要连续按动数次，使管内空气同工作环境空气交换，保持管内工作负压恒定·调体积选取钮至所需值，在移液管下端插上塑料吸嘴，轻轻扭转以保证所密·垂直持握枪式移液器外壳，按下大拇指至第1档·将吸嘴垂直地浸入所需取样液内，深度为2~3毫米，徐徐松开大拇指，使之返回原来位置。·停留1――2秒，平缓地将移液管取出，同时应避免吸嘴与任何东西碰撞。·将吸液嘴移至加样容器壁上，缓慢按动按手至第一档，将液体排了。停留1秒（粘性较高的溶液停留时间可长些）。紧接着再将按手按至第二档，排出吸嘴里的全部液体。（要求动作连）。·完全排出液体后，小心地连同吸嘴沿着容器壁向上滑动取出。·再放松按手，使之返回原来位置，即完成一次操作。如需移取另一样品，按枪头排放钮，更换枪头注意：·移液器是精密量取，不允许将移液器直接与液体接触。·不使用时也应插上塑料吸嘴，以免液体或染色液吸入移液器内，导致阻塞。·移取过程中应控制速度，力度。·塑料吸嘴可经受100℃高温高压消毒。（二）混匀操作(1)旋转法：手持容器，使溶液作离心旋转(2)指弹法：一手执试管上端，另一手轻弹试管下部，：使其中液体作涡旋运动。(3)搅动法：使用玻璃棒搅边；多用于溶解烧杯中的固体。(4)混匀器法：将试管置于混匀器的振动盘上，逐渐用力下压，使内容物旋转。(5)倒转混匀：适用于具塞的容器，如容量瓶、具塞量筒及具塞离心管等。操作时，将容9器反复倒转。试管内的液量太多，也可利用倒转混匀法，外面包以玻璃纸塞住管口，然后用手指按住橡皮塞将试管反复倒转，溶液即可充分混匀。(6)吸管混匀法：用吸管将溶液反复吸吹数次，以达到混匀的目的。（三）加热与保温操作1、加热(见图1~5；图1~6)2、保温①使用恒温水浴箱，调节温度设定钮至需要的温度。②水浴箱中水要足量。③实验过程中应随时监测温度，并及时调节。10（四）离心操作离心沉淀法：当颗粒小而不均一，沉淀粘稠或容积小又需精确定量时，往往采用离心沉降法。1、离心前检查：①取出所有套管，起动空载的离心机，看是否转动平稳。②检查套管有无软垫，是否完好，内部有无异物。③离心管与套管是否匹配。2、平衡：将一对离心管放入套管，置于天平两侧，用滴管较轻一侧的离心管与套管之间加水至两侧平衡(离心管及其内溶液量不能差别过大)3、离心：将等重的两管置于离心机中的对称位置，调转速调节钮，逐渐增加转速至所需值，计时，离心结束后，将套管中的水倒净，所有套管放回离心机中。4、使用注意①根据需要选择合适的转速、时间；②选择合适的离心管，做到对称平衡；③启动时应由低速慢慢加至所需速度④离心结束关机后，应让其自然停止，不可用手或其它物品强迫停止（五）点收仪器根据仪器清单，逐项查点是否完好(如有缺损向教师声明及时补充更换)第二部分分光光度法当光线通过透明溶液介质时，其幅射能量有部分被溶液吸收，一部分透过，所以光线射出溶液介质之后光能被减少。对溶液来说，溶液呈现不同的颜色，是由于溶液中的质点(分子或离子)选择性地吸收某种颜色的光所引起的。如果各种颜色的透过程度相同，这种物质就是无色透明的，若只让一部分波长的光透过，其它波长的光被吸收，则溶液就呈现出透过光的颜色，并与被吸收的光的颜色完全互补。任何一种溶液，对不同波长的光的吸收程度是不相等的，一些有色物质可以选择性地吸收一部分可见光区的光的能量而呈现不同颜色，一些物质却能特征性地选择吸收紫外线的能量。物质吸收由光源发出的某些波长的光可形成特定的吸收光谱。由于物质的吸收光谱与物质的分子结构有关，而且在一定条件下其吸收程度与该物质的浓度成正比，所以可利用物质的特定吸收光谱对其进行定性和定量分析。分光光11度法是利用各种物质所具有的这种吸收特征所建立起来的分析方法。一、分光光度分析法的基本原理劳伯—比尔定律(Lambert-Beerlaw)是讨论吸收光能与溶液浓度和溶质层厚度之间关系的基本定律，是分光分析的理论基础。劳伯—比尔定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体（一）Lambert氏定律一束单色光通过透明溶液介质时，光能被吸收一部分，被吸收光能的量与溶液介质厚度有一定比例关系(见图2—1)。表达式为这里I0为入射光强度I为通过溶液介质后的光强