《生物化学实验》教学大纲

《基础生物学实验B》教学大纲课程编号：08207017学时：51学分：1.5开课对象：生物科学专业课程类别：专业必修英文名称：BasicBiologyExperimentsB一、课程任务、目的生物化学是四年制本科生物专业开设的一门专业基础课，其中生物化学实验是重要环节。本实验课程通过生物化学分离、制备、分析、鉴定等实验（如滴定、比色、层析、电泳等），加强对学生基本技能的训练。同时要求学生了解掌握一些生化研究的理论和技术，为进入生命科学各分支学科的研究邻域打下基础。二、课程内容与基本要求实验一甲醛滴定法测定氨基氮一、目的要求：初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点二、器材：滴定管、吸量管、试管三、内容与方法：1、滴定标准甘氨酸，计算氨基氮回收率2、滴定未知浓度甘氨酸，计算氨基氮3、计算未知甘氨酸浓度实验二考马斯亮蓝染色法测蛋白质含量一、目的要求学习和掌握考马斯亮蓝G-250法测蛋白质含量的原理和方法。进一步掌握721型分光光度计的使用方法和原理。二、器材：721型分光光度计离心机研钵容量瓶刻度吸管试管三、内容与方法1、制备样品溶液2、制作标准曲线3、测定实验三血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳一、目的要求：学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。二、器材：稳流稳压电泳仪、水平电泳槽、醋酸纤维薄膜、镊子、白瓷反应板、大培养皿三、内容与方法：1、浸泡薄膜2、点样3、电泳4、染色5、漂洗实验四凯氏定氮法测定总氮量一、目的要求：学习凯氏定氮法的原理和操作技术。二、器材：凯氏定氮仪、电炉、消化烧瓶、滴定管、吸量管三、内容与方法：1、消化2、蒸馏3、滴定实验五Folin－酚法测蛋白质浓度一、目的要求：掌握Folin－酚法测蛋白质浓度的原理和方法，学习标准曲线的制备。二、器材：试管、试管架、吸量管、恒温水浴锅、721分光光度计三、内容与方法：1、制备标准曲线（蛋白质浓度与反应生成的蓝色物质的光吸收值的关系曲线）2、未知浓度的蛋白与Folin－酚试剂反应，测出兰色物质光吸收值3、从标准曲线上查出对应蛋白浓度实验六苯丙氨酸聚氨酶（PAL）活力和比活力测定一、目的要求1、学习一种常用的酶活力测定法，并与前面学过的二种酶活力测定法相比较；2、掌握苯丙氨酸解氨酶活力与比活力测定的原理与方法，为后面该酶分离纯化的实验中测活力与比活力所需要；3、了解紫外分光光度计及其使用。二、器材：电子天平高速冷冻离心机恒温水浴紫外分光光度计721分光光度计剪刀研钵试管刻度小试管塑料离心管刻度吸管烧杯三、内容与方法1、提取酶液2、酶活力测定3、蛋白质含量测定4、计算实验七硫酸铵分级沉淀分离苯丙氨酸解氨酶一、目的要求了解硫酸铵沉淀蛋白质的原理，掌握分级沉淀分离酶的基本操作和方法。二、器材天平冷冻离心机恒温水浴紫外分光光度计钟表冰浴试管烧杯玻棒刻度吸管研钵剪刀量筒离心管三、内容与方法1、酶液提取2、硫酸铵分级沉淀3、沉淀样品溶解4、酶活力测定实验八凝胶层析纯化苯丙氨酸解氨酶一、目的要求掌握葡聚糖凝胶柱层析法脱盐的原理和基本操作方法，分离上一个实验所得沉淀液中的酶蛋白和硫酸铵。二、器材层析柱紫外分光光度计721分光光度计恒温水浴钟或手表刻度吸管刻度试管试管滴管三、内容与方法1、层析脱盐：凝胶溶胀，灌胶，层析，收集2、酶活力测定3、蛋白质含量测定实验九过氧化物酶活力测定一、目的要求：了解酶活力、比活力概念，通过测定过氧化物酶活力，掌握酶活力测定的一般方法。二、器材：天平、研钵、离心机、试管、量筒、恒温水浴锅、721分光光度计三、内容与方法：1、酶液制备（植物样品在酶抽提液中磨成匀浆，取清液）2、酶活力测定（愈创木酚溶液中加入一定量酶液，再加入过氧化氢溶液，迅速混匀并测定）实验十聚丙烯酰胺凝胶电泳分析过氧化物酶同工酶一、目的要求1、学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。2、学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术。二、器材电泳仪一套（包括稳压电源及垂直电泳槽）高速离心机真空泵及抽滤器烘箱（或培养箱）细玻管及玻璃架研钵注射器培养皿烧杯橡皮膏、剪刀等三、内容与方法1、样品制备2、凝胶制备3、装槽4、点样5、电泳6、取胶7、染色实验十一底物浓度对酶促反应影响一、目的要求：了解米氏常数意义，学习测定米氏常数的原理和方法。二、器材：锥形瓶、吸量管、滴定管、量筒三、内容与方法：1、磷酸缓冲液配制（pH7.0,0.2M）2、KMNO4浓度标定3、H2O2浓度的标定4、H2O2酶制备5、反应速度测定6、关系曲线制作7、求出Km实验十二血清胆固醇的测定一、目的要求：了解掌握测定胆固醇的原理和方法二、器材：试管、试管架、容量瓶、吸量管、离心机、分光光度计三、内容与方法：1、血清经无水乙醇处理，使蛋白沉淀2、设置胆固醇标准管、样品管，分别与磷硫铁试剂反应，测定A5603、计算血清蛋固醇含量实验十三还原糖和总糖的测定一、目的要求：了解3.5一二硝基水杨酸化色法测定糖原理，掌握还原糖及总糖定量测定的操作方法。二、器材：天平、烧杯、离心机、容量瓶、恒温水浴锅、白瓷板、分光光度计三、内容与方法：1、面粉样品中还原糖提取（水溶解法）2、面粉样品中总糖的提取（沸水溶中酸水解）3、标准曲线制备4、样品待测液的测定5、标准曲线上查找相应糖含量实验十四、油料作物脂肪抽提和含量测定一、目的要求学习脂肪的提取和测定方法二、器材索氏脂肪抽提器(一套)，分析天平，恒温水浴锅，烘箱，干燥器。三、内容与方法1、样品烘干、磨碎2、滤纸包好样品3、抽提4、烘干称重实验十五水果中维生素Ｃ的测定一、目的要求：了解一种维生素Ｃ的测定方法和原理。二、器材：研钵、试管、离心机、721分光光度计三、内容与方法：1、水果中维生素Ｃ提取2、标准曲线制作及样品测定实验十六酵母RNA的提取及鉴定一、目的要求了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。二、器材1、乳钵2、150ml锥形瓶3、恒温水浴箔4、量简5、布氏漏斗及抽滤瓶6、吸管7、滴管8、试管及试管架9、烧杯10、离心机11、漏斗三、内容与方法1、RNA提取，干燥2、嘌呤碱、核糖、磷酸等的鉴定实验十七定磷法测定核酸浓度一、目的要求掌握利用核酸定磷测定法测定核酸的含量。二、器材分析天平，722型分光光度计，恒温水浴，200℃恒温烘箱或万用电炉，移液管，凯氏烧瓶4个，烧杯，容量瓶，培养皿一个，称量瓶一个，干燥器，试管20ml×20，离心管4个水浴锅1个，药勺1个。三、内容与方法1、样品的消化2、用标准磷溶液制作标准曲线3、总磷量的测定4、无机磷测定5、计算实验十八脱氧核糖核酸的琼脂糖凝胶电泳一、目的要求1、掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。2、学习利用琼脂糖胶电泳方法测定DNA片段大小。3、学习有关建立DNA限制性内切酶图谱的基本技术。二、器材Eppendorf离心管（1.5ml，经消毒），电泳槽，电泳仪，凝胶塑料托盘，电泳样品槽模板（梳子），锥形瓶（100ml），小烧杯（50，100，250ml），橡皮膏，电热恒温箱，玻璃纸。三、内容与方法1、DNA的酶解2、凝胶的制备3、点样4、电泳5、染色6、观察实验十九纸层析法分析生物体内的转氨反应一、目的要求1、掌握纸层析法基本原理和操作方法。2、利用纸层析法分离氨基酸，进而了解生物体内的转氨基作用。二、器材（1）研钵（2）试管及小离心管10ml*4（3）天平（4）刻度吸管1ml*82ml*2（5）离心机（6）恒温水浴（370C）（7）沸水浴（8）层析纸、铅笔、小尺（9）毛细管（10）电吹风机（11）订书机（12）层析缸、培养皿（13）喷雾器三、内容与方法1、酶液的制备2、转氨反应3、裁纸4、点样5、扩展6、显色7、计算三、课程难点与重点生物化学实验内容较为复杂，操作要求高，所需时间长，应成分调动学生的积极性。四、实践环节及基本要求各实验尽量采用学生较为熟悉的材料，用生产实践和各研究领域常用的实验方法和技术。五、对学生能力培养的要求通过生物化学分离、制备、分析、鉴定等实验（如滴定、比色、层析、电泳等），加强对学生基本技能的训练，培养学生创造性思维能力。了解掌握一些生化研究的理论和技术，为进入生命科学各分支学科的研究邻域打下基础。六、学时分配（总学时数为51，包括实验理论部分、6个必做实验和3~4个选做实验）1、实验理论部分（总14学时），包括：电泳技术（5学时），层析技术（4学时），核酸研究方法（5学时）。2、必做实验（总学时为25）序号实验内容学时数1Folin－酚法测蛋白质浓度32苯丙氨酸解氨酶（PAL）活力和比活力测定43过氧化物酶活力测定44过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳85面粉中还原糖和总糖的测定36酵母核糖核酸的提取和组分鉴定33、选做实验（选做下列实验中的3~4个，完成12学时的实验内容）序号实验内容学时数1甲醛滴定法测定氨基氮32考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量33硫酸铵分级沉淀分离苯丙氨酸解氨酶64凝胶层析法纯化苯丙氨酸解氨酶65底物浓度对酶促反应速度的影响66血清胆固醇的测定37粗脂肪的提取和定量测定38水果（蔬菜）中Vc含量的测定39纸层析法分析氨基酸的转氨反应410脱氧核糖核酸的琼脂糖凝胶电泳311血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳312凯氏定氮法测定总氮量813定磷法测定核糖核酸纯度6七、考核方式由平时成绩和期末考查成绩两部分组成，以平时成绩为主。八、教材和参考书1、基础生物化学实验，北京师范大学生物系编，高等教育出版社，1982。2、生物化学实验原理和方法，李建武等编，北京大学出版社，1994。3、自编材料。