《生物技术大实验》实验指导书

《生物技术大实验》实验指导书前言《生物技术大实验》是为生物技术专业本科高年级学生开设的综合实验课程，是在普通生物学实验、生物化学实验、微生物实验、细胞生物学和遗传学实验的基础上的综合实验课程。该实验课程偏重于分子生物学实验教学，通过此实验课程，学生不仅学习1到最基本的分子生物学技术，而且学习到前沿的生物技术。分子生物学实验技术突飞猛进，日新月异。分子生物学技术的广泛应用，在20世纪下半叶对生命科学的进步产生了举世公认的巨大推动作用，而且对人们的生活和整个社会的发展亦产生了巨大的冲击和影响。分子生物学技术已广泛渗透和应用到生物学、遗传学、细胞学、微生物学、进化学、肿瘤学、免疫学、药理学、发育学、病毒学、神经生物学、生药学、法医学等与基础医学和临床医学有关的研究领域。21世纪将更是分子生物学技术快速发展的时期，由此引起的生物技术革命并将更加深刻地影响社会的发展。学生基本技能和动手能力的培养都离不开实验室，离不开实验课上的训练，很多理论上的原理都需要到实验课上去验证，很多理论上的知识都需要到实验课上去实践。而实验课教材或实验指导书是开好实验课的基本条件之一。虽然目前的分子生物学实验教材版本众多，但针对本科生的生物技术大实验教材尚无出版。为了加强本学科的教材建设，促进本学科实验课的开设，我们参考了国内外最新的有关分子生物学实验技术的专著，根据我校学生的特点及我们自己现有的基础和条件，特选择了部分实验内容，并结合我们的经验与体会，汇编成了生物技术大实验实验指导书，以供参考。在使用过程中，可根据不同的层次适当增减。同时，对于新近产生和应用前景广阔的生物芯片技术、RNAi技术和蛋白质组研究等，限于我们目前的条件，只能作些演示或作为动态给以介绍，条件一经成熟，即行开设。由于分子生物学技术和生物技术的快速发展，加之我们是第一次这样系统地给学生开设生物技术大试验课程，许多工作还处于不断探索的过程中，难免有不妥和疏漏之处，恳切期望读者提出宝贵意见，以利不断修正完善。编者目录实验一质粒的提取和纯化…………………………………………….3实验二质粒DNA的电泳和纯度检测…………….……………………..6实验三PCR产物的TA克隆……………………………………………...9实验四感受态大肠杆菌细胞的制备…………………………………...122实验五重组DNA转化大肠杆菌…………………………………........12实验六PCR扩增基因特异片段………………………………………..15实验七DNA片段的回收及纯化………………………………………..19实验八PCR法快速鉴定重组载体……………………………………...22实验九限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒…………………………...24实验十外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测……………………….28实验十一RNA的提取及其纯度检测……………………………………32实验十二逆转录PCR（RT-PCR）扩增基因特异片段…………………..35实验十三DNA探针制备……………………………………………..…38实验十四Southern印迹杂交……………………………………………41实验十五Northern印迹杂交……………………………………………44实验十六荧光原位杂交（FISH）技术…………………………………47实验十七外源基因在哺乳细胞中的表达及其检测…………………...50实验十八生物芯片技术………………………………………………...53实验十九RNAi技术……………………………………………………56实验二十蛋白质组技术………………………………………………...58附录基因工程基本技术路线…………………………………………….60实验一质粒的提取和纯化实验目的：了解碱裂解法制备质粒的原理，掌握质粒的小量制备方法。实验原理：质粒DNA的抽提是基因工程操作中最常用与最基本的技术，现已有多种成熟的方案可供选择。最常用的有利用碱性条件下质粒DNA与染色体DNA变复性的不同进行分离的碱法；利用酸性、低离子强度时超螺旋在水相中，开环、线型分子在酚相中进行分离的酸酚法；利用羟基磷灰石在特定的条件下(8mol／L尿素，0.24mol／L磷酸缓冲液pH＝6.8)只吸附双链DNA的羟3基磷灰石法(在上述条件下染色体DNA均成单链，质粒DNA保持双链)等。本实验选做的是碱法。1.裂解细胞裂解细胞是指通过溶菌酶、去污剂等试剂破裂细胞壁与膜的过程。对于不同的菌要选用不同的方法，通常有煮沸法、非离子型去污剂法、碱性SDS法(简称碱法)等。三种方法比较而言，非离子型去污剂法较温和，适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈，只能抽提小于10kb的质粒。常用的离子型去污剂是SDS、非离子型去污剂有TritonX-100等。2．分离即将质粒DNA和染色体DNA分离。碱法的分离原理如下：大肠杆菌的染色体约有4700kb长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双链DNA片段。当溶液的pH调到大于12时双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链分离成单链；而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢键被破坏，并只发生部分双链解离成单链的变化。再当pH调回中性时单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。3．纯化细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外还有各种细胞壁、膜碎片、蛋白质、脂质类物质及RNA。纯化的步骤就是有针对性地将它们去除。RNA可用牛胰RnaseA分解除去。蛋白质可通过酚、酚／氯仿、氯仿／异戊醇，使蛋白质变性剂而除去，同时，氯仿有强烈的溶脂倾向，对于在除去蛋白质的同时去除脂质类杂质很有好处。氯仿还能将微量的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉，而微量的酚对于以后的酶切、转化等过程都会产生不利影响。氯仿／异戊醇的蛋白质变性能力较弱，主要用于含酚试剂处理后的抽提。正确的去除蛋白质杂质的过程应该是酚一酚+氯仿（(1:1)）一氯仿（或氯仿／异戊醇24:1)，处理，根据实验情况也可考虑省略第一或第二步，但切记不可将氯仿（氯仿／异戊醇）的处理步骤省略掉。抽提过程完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法将它们除去。用无水乙醇沉淀的特点是能将DNA进行浓缩，且同时也更换了整个缓冲系统，但DNA也有一定的损失。实验内容：试剂1.LB培养液(1L)细菌培养用蛋白胨10g细菌培养用酵母粉5gNaCl10g用10mol／LNaOH调至pH7.0，高压蒸气灭菌,4℃贮存.2．溶液Ⅰ，可成批配置，灭菌后4℃贮存。葡萄糖50mmol／LTris-C1(pH8.0)25mmol／LEDTA10mmol／L3．溶液Ⅱ(新鲜配制)NaOH0.2mol／L4SDS1％4．溶液Ⅲ5mol／LKAc60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml配制好的溶液Ⅲ含3mol／L钾盐，5mol／L醋酸(pH4.8)卡那霉素(Kana):50mg/ml,过滤除菌.5．重蒸酚市售苯酚蒸馏纯化(收集179～181℃之间的酚)后，用TE饱和，使水相的pH在7.5以上，4℃保存。6．氯仿异戊醇(24:1)7．无水乙醇8．RNaseA(10mg／ml)9．3mol／LNaAc(pH5.2)10．TE10mmol／LTris-C1(pH8.0)1mmoI／LEDTA材料含有质粒(pNTE-EGFP,pEGFPN3)的大肠杆菌DH5a.操作步骤1．挑取琼脂培养板上的含有pNTE-EGFP,pEGFPN3质粒的单菌落，接种至5mlLB培养液(含Kana50μg／m1)，37℃振荡培养过夜。2．取出1.5ml培养液至1.5ml离心管中，12000r／min离心2min，弃上清。3．将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液工中，强烈振荡混匀。4．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖，轻轻颠倒混匀5次，冰浴5min。5．加入150μl预冷的溶液Ⅲ，温和振荡10s，冰浴5min。6．12000r／min室温离心5min，取上清至一个新的无菌的1.5m1Eppendorf管中。7．加入等体积酚／氯仿(1:1)，振荡混匀，12000r／min离心2min，上清转移至另一个Eppendorf管中。【注意】酚具有腐蚀性，操作时小心。8．加人等体积氯仿，振荡混匀，12000r／min离心2min，上清转移至另一个Eppendorf管中。10．加入2倍体积预冷无水乙醇-20℃沉淀10min。11．12000r／min离心10min，去上清，沉淀用70％乙醇洗涤一次，空气中晾干。12．加入20μlTE溶解质粒DNA，加入RNaseA，终浓度20μg／m137℃水浴0.5h。13经0.7％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后观察抽提结果。【注意】EB为致癌物，操作时一定要戴乳胶或一次性手套。14．将该管质粒保存于-20℃备用。注意事项1．该实验成功的标志是把染色体DNA、蛋白质与RNA去除干净，获得一定得率的质粒DNA。去掉染色体DNA最为重要，也较困难，因为在全部提取过程中，只有一次机会去除染色体DNA，其关键步骤是加入溶液Ⅱ与溶液Ⅲ时，控制变性与复性操作时机，既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性，又要使染色体DNA不断裂解成小片段，从而能与质粒DNA相分离。这就要求试剂与5溶菌液充分摇匀，摇动时用力适当，一般来说当溶液Ⅰ加入时可用力振荡几次，因为此时细菌还没有与碱和SDS作用，染色体DNA尚未释放，不必担心其分子断裂，加入SDS后，则要注意不能过分用力振荡，温和混匀,但又必须让它反应充分。加入溶液II混匀之后,一定在冰上放置,不要摇动,对于溶液溶液III,同样处理!2.加入溶液I之前,注意将离心管倒扣过来,将培养基完全流出.2．加乙醇沉淀DNA时，要把离心管加盖倒翻摇动4～5次，注意观察水相与乙醇之间没有分层现象之后，才可以放在冰箱中去沉淀DNA,以获得更多的DNA。3．乙醇沉淀DNA离心后，要把离心管四周的上清液抽干或自然挥发(可将离心管倒置于滤纸上以尽量让管内液体流出)。否则，用TE缓冲液溶解DNA时，既困难又不完全。4．为了得到纯净的DNA样品和清晰的电泳条带，加入1μlRNA酶，将管置50℃水浴箱内30min，消化RNA。6．抽提产物经电泳分离、EB染色后，在紫外线灯下可观察到三个条带，自前往后分别为：超螺旋、线性及开环质粒DNA。【思考题】碱法提取质粒的原理是什么？【课外阅读】高纯度质粒DNA的提取,参阅Qiagen公司说明书,网站:的电泳和纯度检测实验目的：掌握DNA琼脂糖电泳技术，了解紫外分光光度法测定DNA浓度和纯度的原理。实验原理：带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。其中，凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，使它成为分离、鉴定和提纯核酸的首选标准方法。与蛋白质分子类似，核酸分子也是两性解离分子。在pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷酸基团中只有第一个磷酸解离，整个分子带正电荷，在电场中向负极泳动；在pH值为8.0～8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动。不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。所以采用适应浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的。值得注意的是，等长度的单链DNA和双链DNA在中性或碱性凝胶中的迁移率大致相等。1．影响泳动的四大因素(1)影响泳动的首要因素是电泳样品的物理性质：包括电荷多少、分子大小、颗粒形状和空间结构。一般来说颗粒带电荷的密度愈大，泳动速率愈快；颗粒物理形状愈大，与支持物介质摩擦力越大，泳动速度越小。即泳动率与颗粒的分子大小，介质粘度成反比；与颗粒所带电荷成正比。在检测未知DNA分子量时，DNA分子的空间构型不同，即使相同的分子量其迁移率也不同。如质粒DNA存在闭环(Ⅰ型，CC)，单链开环(Ⅱ型，OC)和线性(Ⅲ型，L)。三者之间的迁移速率，一般为Ⅰ型Ⅲ型Ⅱ型，但是