《食品生物技术》实验指导书

《食品生物技术》实验指导书北京农学院食品科学系张红星、徐文生编著二00六年九月1实验一质粒DNA的小量制备1．目的学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。2．原理根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0∼12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。3．器材超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。4．试剂pET-his质粒载体菌,pMD18-T-NK载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液I），NaOH/SDS溶液(溶液II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液III)，RNaseA，95%乙醇，70%乙醇，TEbuffer（pH8.0）。5．实验准备氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20°C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g加200mLddwater搅拌完全溶解，用约200μL5NNaOH调pH至7.0，加ddwater至1L，121°C20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTrisHClpH8.0，10mmol/LEDTApH8.0）；溶液II（0.2mol/LNaOH，1%SDS）；溶液III（60mL5mol/LKac，加冰乙酸调pH4.8，补ddwater至100ml），70%乙醇（-20°C保存），TEbuffer（10mmol/LTrisHClpH8.0，1mmol/LEDTApH8.0）；10mg/mLRNaseA（RNA酶A溶于10mmol/LTrisHClpH7.5，15mmol/LNaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121°C30min）。6．操作步骤（1）在超净工作台中取5mlLB（Amp+），加入灭菌的摇菌管中。（2）从超低温冰箱中取出保存pET-his载体的菌种和pMD-18T-NK的菌种（操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融化！），在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37°C摇床中摇20h。pET-his菌：接种于5mlLB（Amp+）；pMD18-T菌：接种于2mlLB（Amp+）（3）取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。pET-his菌：3管（3×1.5ml）；pMD18-T菌：1管（1.5ml）（4）在沉淀中加入100μl溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。）（5）加入200μl溶液II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。（6）加入150μl溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。（7）15000rpm离心5min，小心吸取400μl上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800μl95%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（8）15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，加入500μl70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净（9）再加入500μl70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净（10）离心管倒置于37°C培养箱中（或室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！）。（11）pMD18-T加入30μl无菌蒸馏水或TE缓冲液；3管pET-his质粒中每管加入10μl蒸馏2水混匀后收集到一个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬时转一下，使溶液集中在管底。待电泳确认（见实验二）后再在pET-his质粒中加入1μlRNaesA。用记号笔标记后放入冰箱中备用。（12）在剩余的菌液中倒入少许84消毒液，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒入下水池。清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告7．思考Š１．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及实验中分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。Š２．简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因。Š3.沉淀ＤＮＡ时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行？3实验二质粒DNA电泳鉴定1．目的学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳、。2．原理DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。3．器材电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml离心管，双面微量离心管架，试管架等。4．试剂5．实验准备配制TAE电泳缓冲液（50×储存液，pH约8.5：Tris碱242g，57.1ml冰乙酸，37.2gNa2EDTA.2H2O，ddwater定容至1L），1000×溴化乙锭储存液（0.5mg/ml：50mg溴化乙锭溶于100mLddwater，4°C避光储存），10×加样缓冲液（20%Ficoll400，0.1mol/LNa2EDTApH8.0，1.0%SDS，0.25%溴酚蓝）；6×加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）；1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。6．操作步骤（1）称取0.5g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50mlTAE电泳缓冲液(1×)，放入微波炉中烧开（1min）。50ml正好倒两块小胶。（2）注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。（3）戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约50-60°C）。（4）把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置10-20分钟待胶完全凝固。（剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用）。（5）在水平电泳槽中加满1×TAE电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V(10V/cm)，注意正负电极的位置连接正确。（6）待胶完全凝固后（15-20分钟），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。（7）剪1片光面纸（或封口膜），点6μl蒸馏水、1μl10×加样缓冲液，再加入3μl质粒DNA溶液制成10μlDNA样品。（8）在凝胶上选择相邻的加样孔。用10μl的吸液头分别将管中的样品加入凝胶的加样孔中（如果需要时，在相邻的加样孔中加入1.5-3μlDNA分子量标准物）。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到孔外。（9）打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动（如果发现蓝色向后移动，立即关闭电源，调换电极）。电泳将进行约30min。（10）当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。取出模具和凝胶。（11）把凝胶小心反扣放入盛有EB的搪瓷盒中。放置约10分钟后，取出用自来冲洗两次。放入凝胶成像系统中拍照。（12）清理垃圾。染有EB的凝胶要放到专用的垃圾袋中作专门处理，以免污染环境。（13）撰写实验报告。7．思考（1）泳道中的质粒DNA有几条带？为什么？（2）溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA?（3）影响本实验结果的因素有哪些？4实验三PCR扩增制备目的基因1．目的学会PCR操作的基本技术。2．原理是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍。其中25nt的引物退火温度Tm=2（A+T）+4（G+C）。3．器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2mlPCR微量管，双面微量离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。4．试剂3U/μlTaqDNA聚合酶，PCR缓冲液（10×，MgCl2free），25mMMgCl2，dNTP，引物，模板质粒pMD18-T-NK，无菌ddwater。5．实验准备dNTP混合液（每种25mM），TAE电泳缓冲液，1000×溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10×加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。合成的引物：Senseprimer5'-GGATCCGCGCAATCTGTTCCTTATGGC-3'BamHIAntisenseprimer5'-GAATTCTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG-3'EcoRI目的基因模板质粒（遗传研究室惠赠）：已经克隆在pMD18-T载体上的基因。6．操作步骤（1）在0.2mlPCR微量离心管中配制50μl反应体系。（以下加样量供参考，括号内是最终需要量，实验时需参照Taq酶说明书计算）ddwater32μl10×PCRbuffer（不含MgCl2）5μl25mMMgCl23μl2.5mmol/LdNTP4μl（每种dNTP终浓度0.2mM）10μmol/LPrimer12μl（12.5—25pmoles）10μmol/Lprimer22μl（12.5—25pmoles）模板质粒1μl（1×10-3pmoles）3U/μlTaq酶1μl（3u）总体积50μl（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序：①94℃5min②94℃1min③60℃1min④72℃1min50s⑤goto②29times⑥72℃10min（3）PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是否有预计的主要产物带。（4）清理桌面，撰写实验报告。（5）PCR产物可以直接与T载体连接（见实验五），然后转化感受态细胞（见实验八）。7．思考（1）复性温度如何确定？（2）为什么要在最后延伸10min？（3）是否有非特异性扩增产物（或引物二聚体），如何才能消除？5