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1新情境·激趣引航血红蛋白是红细胞的主要成份。每个血红蛋白分子由4个血红素基团与珠蛋白构成，每个血红素又由4个吡咯环组成，在环中央有一个铁原子。血红蛋白中的铁在二价状态时，可与氧呈可逆性结合(氧合血红蛋白)，如果铁氧化为三价状态。血红蛋白则转变为高铁血红蛋白，就失去了载氧能力。2新课堂·互动探究学习目标1.尝试对血液中血红蛋白的提取和分离。2.体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法。3.了解色谱法，电泳法等分离生物大分子的原理。新知预习一、分离蛋白质的原理与方法1．分离蛋白质的原理蛋白质特性的差异分子的形状和大小所带电荷的性质和多少溶解度吸附性质对其他分子的亲和力2．分离蛋白质的方法(1)凝胶色谱法①概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，也叫分配色谱法。②过程及原理a.凝胶形态：微小的多孔球体组成：大多数由多糖类化合物构成结构：内部有许多贯穿的通道b．分离的过程c.分离原理：依据相对分子质量的不同而将蛋白质分离。(2)电泳法①电泳的概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。②原理：利用了待分离样品中各种分子的带电性质的差异、分子本身的大小以及形状的不同，使带电分子在电场中产生不同的迁移速度，从而分离样品中的各种分子。③分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。其中后者使用时通常加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子的大小。3．缓冲溶液(1)组成：通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例，可配制不同pH的缓冲液。(2)作用：抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。激趣应用1——缓冲溶液的成分是怎样的？缓冲溶液中含对酸碱起缓冲作用的缓冲对，每一缓冲对均由弱酸和相应的强碱盐组成。细胞外液也有酸碱缓冲对，你能回忆并说出细胞外液中的酸碱缓冲对吗？提示：细胞外液中主要的酸碱缓冲对有：H2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4等。二、凝胶色谱法的实验操作1．蛋白质的提取和分离步骤(1)样品处理2粗分离：透析方法：将血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入一定量适宜浓度的磷酸缓冲液pH为7.0中，透析12h目的：除去样品中相对分子质量较小的杂质(3)纯化：凝胶色谱法(4)纯度鉴定：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳2．凝胶色谱操作(1)凝胶色谱柱的制作(2)凝胶色谱柱的装填(3)样品的加入与洗脱①加样前：打开下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。②加透析样品调整缓冲液面：与凝胶面平齐。↓滴加透析样品：用吸管将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端。↓样品渗入凝胶床：加样后，打开下端出口，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。↓洗脱：打开下端出口，用20_mmol/L的磷酸缓冲液洗脱。↓收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5_mL收集一管，连续收集。3．操作提示(1)红细胞的洗涤：洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离效果。(2)色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶用沸水浴加热，加速膨胀。(3)凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。(4)蛋白质的分离：如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。激趣应用2——凝胶色谱柱和固定化酶的反应柱有何区别？(1)凝胶色谱柱和固定化酶的反应柱都装填有不能通过“柱”下端多孔板(或多孔筛板)的颗粒，它们的颗粒功能有何不同？(2)凝胶色谱柱和固定化酶的反应柱都能进行化学反应吗？提示：(1)凝胶色谱柱装填的是凝胶颗粒，允许小分子进入，不允许大分子进入，通过延长小分子的路程使大分子与小分子分离。固定化酶的反应柱装填的是固定有酶的载体颗粒，既能催化反应物的反应，又保证了酶与反应物分子的分离，实现了酶的重复利用，节约了生产成本。(2)不是。固定化酶的反应柱能进行化学反应，凝胶色谱柱不能进行化学反应。3新课堂·互动探究知识点一血红蛋白的提取和分离的原理1．蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析：相对分子质量大相对分子质量小直径大小大于凝胶颗粒空隙直径小于凝胶颗粒空隙直径运动方式垂直向下运动无规则的扩散运动运动速度较快较慢运动路程较短较长洗脱顺序先从凝胶柱中洗脱出来后从凝胶柱中洗脱出来2.电泳方法：琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，使其迁移速度完全取决于分子的大小特别提醒(1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。(2)测定蛋白质的相对分子质量常用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所带电荷的性质和分子的形状。典例精析2015·邛崃月考利用凝胶色谱法分离蛋白质的原理是()A．蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小B．蛋白质相对分子质量的大小C．蛋白质所带电荷的多少D．蛋白质溶解度的大小【解析】凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法，相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长，移动的速度慢，相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，因此相对分子质量不同的蛋白质得以分离。【答案】B跟踪练习1．凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是()A．改变蛋白质分子通过凝胶时的路径B．吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度C．将酶或细胞固定在细胞中D．与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速率【解析】凝胶是一些微小的多孔的球体，较小的蛋白质分子进入凝胶内部，所经过的路径长，所以洗脱出来较慢，而较大的蛋白质分子则相反，并且，由于凝胶种类多，孔径大小不同，可进一步改变进入凝胶内部不同大小蛋白质的路径。【答案】A知识点二蛋白质提取和分离的实验过程1．样品处理及粗分离2．凝胶色谱操作3．纯度鉴定——SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。特别提醒样品处理、分离与纯化的目的不同目的红细胞洗涤去除杂质，如血浆蛋白血红蛋白释放使红细胞破裂，释放血红蛋白分离血红蛋白溶液经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开透析除去样品中相对分子质量较小的杂质纯化除去相对分子质量较大的蛋白质典例精析2015·雅安中学月考红细胞中含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成的，血红蛋白的主要功能是携带O2和CO2，可选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。请回答下列有关问题：(1)血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：__________________________、______________________、____________________和________________________。(2)实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。①加入柠檬酸钠的目的是__________________。②以上所述的过程即是____________________________，它包括____________、__________、分离血红蛋白溶液和透析。样品处理粗分离纯化纯度鉴定防止血液凝固样品处理红细胞的洗涤血红蛋白的释放(3)然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯度鉴定。样品纯化的目的是__________________________________________________________。(4)电泳法利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及__________________________、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。通过凝胶色谱法将相对分子量大的杂蛋白除去分子的大小【解析】血红蛋白提取和分离的程序可分为四步，分别是：样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。在实验中加入柠檬酸钠的目的是防止血液凝固；样品处理包括红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液和透析四步。样品纯化的目的是通过凝胶色谱法将相对分子量大的杂蛋白除去，进而使SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法中迁移速率只取决于分子大小。电泳法利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。跟踪练习2.下图甲乙表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有________功能。(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是________________；乙装置中，C溶液的作用是________________________________。(3)甲装置用于________，目的是________________________。用乙装置分离蛋白质的方法叫______________________________，是根据________________________________分离蛋白质的有效方法。(4)用乙装置分离血红蛋白时，待____________________________接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。(5)血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：样品处理、粗分离纯化、纯度鉴定。其中样品处理包括__________________________、____________________________、收集血红蛋白溶液。运输磷酸缓冲液洗脱血红蛋白透析(粗分离)去除样品中分子量较小的杂质凝胶色谱法相对分子质量的大小红色的蛋白质红细胞的洗涤血红蛋白的释放【解析】(1)血红蛋白具有运输氧气的作用。(2)透析是将血红蛋白溶液装入透析袋，放入磷酸缓冲液。磷酸缓冲液溶液的作用是洗脱血红蛋白。(3)甲装置用于透析(粗分离)，目的是去除样品中分子量较小的杂质。乙装置分离蛋白质的方法叫凝胶色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。(4)乙装置分离血红蛋白时，待红色的蛋白质(血红蛋白)接近色谱柱底端时，用试管收集流出液。(5)样品处理包括：红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、收集血红蛋白溶液。4新思维·随堂自测1.2015·广元实验中学期中凝胶色谱法是根据分离蛋白质的有效方法()A．分子的大小B．相对分子质量的大小C．带电荷的多少D．溶解度【解析】凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，A、C、D三项均错误，B项正确。【答案】B2．将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第2层是()A．甲苯B．血红蛋白水溶液C．脂溶性物质的沉淀层D．其他杂质的沉淀【解析】血红蛋白液离心后分四层，其中第二层是脂溶性物质的沉淀层，A、B、D三项均错误，C项正确。【答案】C3．使用SDS—聚丙烯酰胺电泳的过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于()A．电荷的多少B．分子的大小C．肽链的多少D．分子形状的差异【解析】使用SDS—聚丙烯酰胺电泳的过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小。【答案】B4．红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成的。我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：(1)分离蛋白质分子的一种常用方法是凝胶色谱法，也叫做________________，是根据______________分离蛋白质的有效方法。(2)血红蛋白提取和分离的程序可分为____________、_________