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枯草芽孢杆菌对荧光假单胞菌感染鲤生长和肉质的作用摘要：本实验研究了枯草芽孢杆菌对荧光假单胞菌感染鲤的生长和肉质的影响，初步确定枯草芽孢杆菌的最适添加剂量。将630尾健康鲤鱼分成7组，其中5组用荧光假单胞菌攻毒感染后，饲喂添加不同浓度芽孢杆菌的日粮，剩余2组为对照，以基础饲料分别饲喂健康鲤和感染鲤，28d后采样检测鲤鱼的生长性能和肉质。结果显示：感染后鲤鱼的生长性能和肉质指标都有下降，生长性能随着添加浓度的提高表现出先上升后下降的趋势，其中添加0.5-1×107cfu/g组的添加效果最好，粗蛋白和生长性能与正常组无显著的差异（P0.05)，表明芽孢杆菌在合适的添加浓度下可以改善功毒后鲤鱼的生长性能和肉质指标。关键词：鲤鱼生长性能肉质芽孢杆菌荧光假单胞菌(Pseudomonasfluoroscens)是淡水鱼类赤皮病的主要病原菌，为革兰氏阴性菌[1]。草鱼、青鱼、鲤鱼、鲫鱼等大多数淡水鱼类均可患此病[2]，该病发病范围广，在我国各养殖水域均有流行。给我国淡水养殖业造成了严重的损失。目前，对该病的防治主要用抗生素和化学药剂，效果不甚明显，长期使用造成大量的耐药菌株产生，于此同时鱼肉中药物残留也会危及消费者健康。芽孢杆菌(Bacillus)为一类常用的益生菌，具有抑制有害菌[3]、改善水质[4]、促进动物生长[5]及提高免疫[6]等诸多功能。芽孢杆菌对水生动物肉质的影响研究较少，陆生动物上，陈凤芹[7]等在皖南黄鸡日粮中添加芽孢杆菌，发现肌肉肉样系水力增加，肉质得到显著改善。当前芽孢杆菌研究主要集中在健康动物，而对感染后芽孢杆菌对水生动物生长和肉质影响的研究还未见报到。本实验采用芽孢杆菌制剂添加到日粮中投喂感染鲤，测定供试鲤的生长性能指标和肌肉营养成分，以探讨枯草芽孢杆菌对感染后鲤的生长性能和肉质的影响，从而为芽孢杆菌在水产养殖业中合理使用提供一定的理论和实验依据。1、材料与方法1.1试验材料1.1.1攻毒菌制备荧光假单胞菌菌株由武汉水生生物研究所提供。将荧光假单胞菌接种在液体肉汤培养基中，37℃下培养48h，离心集菌，用灭菌生理盐水清洗3次，并用生理盐水将其浓度调整至1.5×107cells/ml，用作鲤攻毒感染。1.1.2益生菌枯草芽孢杆菌由四川农业大学微生态研究中心，活菌数达2×109CFU/g。1.1.3试剂与器材微量凯氏定氮仪全套，索氏抽提器全套，马福炉，天平，刻度尺。1.2试验鱼及饲养条件实验鲤购自邛崃渔场，体态正常，健康无病，每尾鲤鱼平均体重为(12±2)g。购后置于大水泥池中暂养。饲养前用具和水池用强氯精进行消毒。试验用水使用自然河水，流水饲养。PXC-35精密离子计和水质分析盒监测水质，pH6.8-7.5，溶氧8-10mg/L,水温20-24℃；硫化物、非离子氨、重金属Hg、Cd、Cu、Pb、As符合渔业水质标准(GB11607-89)。1.3日粮配制蛋白质、复合维生素和复合矿物质等需要量参照鲤鱼、大西洋鲑或虹鳟的营养需要，基础日粮配方见表1。试验日粮是在基础日粮基础上添加不同浓度的芽孢杆菌制剂见表2。表1基础日粮配方Table1Compositionandnutrientlevelsofthebasaldiet(DMbasis,%)饲料原料Ingredients含量Content营养水平Nutrientlevels含量Contet豆粕Soybeanmeal33.5粗蛋白CP35.08鱼粉Fishmeal10赖氨酸Try1.85菜籽饼(cp≥36%)20蛋氨酸Met1.13次粉wheatmiddlingandreddog18有效P0.87麦麸wheatbran3.3总Ca0.97棉粕cottonseedmeal(sol.)10粗纤维CF5.70磷酸二氢钙Ca(H2PO4)21.8粗脂肪EE4.18维生素预混料Vitaminpremix0.2a.每千克维生素预混料含:VA（500000IU/g）0.8000g，VD3（500000IU/g）0.4800g，DL－a生育酚醋酸酯（50%）20.0000g，矿物质预混料Mineralpremix0.5VK3（23%）0.2200g，VB12（1%）0.1000g，D-生物素（2%）5.0000g，叶酸（96%）0.5210g，盐酸硫胺素（90%）0.1133g，VC磷酸酯（93%）7.1613g，烟酸（99%）4.1646g，肌醇（99%）52.3232g，泛酸（90%）2.5578g，核黄素（80%）0.6250g，VB6（81%）0.7494g，次粉905.1844g；b.每千克微量元素预混料含量：CuSO4.5H20（25.00%Cu）1.2005g，MnSO4.H2O（31.8%Mn）4.0885g，KI（3.8%I）2.8950g，NaSeO3（1%Se）2.5000，ZnSO4.7H2O（34.5%Zn）14.1130g，FeSO4.7H2O（30%Fe）45.7667g，次粉929.4363g。鱼油Fishoil1.2豆油soybeanoil1.2氯化胆碱(≥50%)cholinechloride0.3总计grandtotal100表2实验分组Table2Therandomgroupsandtreatment处理组1234567重复数3333333鱼尾数/重复30303030303030攻毒处理-++++++日粮中芽孢杆菌含量000.05‰0.25‰0.5‰0.75‰1.0‰1.4饲养管理试验鲤在大池中暂养，以基础日粮投喂，2周后开始正式试验。将暂养后的鲤随机分成7组，感染处理后分别饲喂基础日粮和试验日粮，每组设3个重复，每个重复30尾，组间无显著性差异（P＞0.05），试验持续28d。每天分别在09:00-10:00、16:30-17:00投喂1次，每天按试验鱼体重4%-5%投喂饲料。1.5攻毒感染在实验开始时，对照组腹腔注射0.1ml的无菌生理盐水；感染组腹腔接种上述(含菌量1.5×107cells/ml)细菌培养液0.1ml，分别放回水池中，保持各方面条件相同，观察鱼的变化。1.6样品采集在实验开始后28d采样，每次每箱随机取鲤5尾。采样时鲤鱼停食24h，测体长，体重，用于生长性能的测定；从尾动脉采血进行血液分析，用0.1%的肝素钠抗凝的血液进行生理指标的测定；吸干鱼体表的水分后，于鱼体鳃盖后缘至背鳍第一鳍条处的侧线以上部位取白肌，去皮。-20℃下冷藏备用，用于营养成分的测定。1.7测定指标与方法1.7.1生长性能计算丰满度，绝对生长率，相对生长率，瞬时增长率和生长比速。丰满度，k=100×W/L3；绝对生长率，g=(W2-W1)/(t2-t1)；瞬时生长率，g=(㏑W2-㏑W1)/W1×(t2-t1)；上述公式中，W1为试验开始时体质量(g)，W2为试验结束时体质量(g)，L1为试验开始时体长(cm)，L2为试验结束时体(cm)，t1为试验开始时间(d)，t2为试验结束时间(d)。1.7.2肌肉基本成分测定水分、粗蛋白、粗脂肪与粗灰分。其中水分含量测定采用105℃烘干失水法[8,9]；粗蛋白质测定采用微量凯氏定氮法；粗脂肪测定采用索氏抽提法；粗灰分测定采用马福炉灼烧法(550℃)[8,9]。1.7.3肉质指标失水率的测定[10]：取鱼体背部肌肉5g，称重(W0)，于沸水中煮5min，捞出冷却，用吸水纸吸去表面水分，称重为W1，计算：失水率％=W0－W1／W1×100％。1.7.4血液指标测定红细胞计数(RBC)：用红细胞稀释液(0.089%的氯化钠溶液)，将血液稀释200倍，用血细胞计数板在显微镜下计数。白细胞计数(WBC)：用醋酸龙胆紫稀释液(2%冰醋酸+1%龙胆紫)将血液稀释20倍，用血细胞计数板在显微镜下计数。溶菌酶活力：比浊法测定，具体参照试剂盒说明书。（购自南京建成生物）补体C3/C4：比浊法测定，具体参照试剂盒说明书。（购自伊利康生物技术有限公司）1.8统计分析数据以平均值±标准误表示，试验结果用SPSS13.0软件进行显著性t检验。2结果与分析2.1感染后鲤发病情况试验鱼感染4d后，表现为：精神萎顿，很少游动。陆续出现死亡，死亡鱼统一表现：体表充血，出血，鳃苍白腹部膨大，肛门红肿突出。在接种部位有一块圆形病灶，该处鳞片向外张开，松动易脱落，鳞下体表充血，出血肿胀。腹腔内有红色的腹水，各组织器官均有不同程度的病变，肠壁充血发炎，肝脏肿大，肾也肿大发生病变。2.2生长性能表3鲤鱼生长性能指标Table3GrowingperformanceofCarp项目1234567丰满度%2.71±0.21ab2.56±0.16b2.65±0.16ab2.63±0.22ab2.77±0.27a2.75±0.23a2.63±0.21ab绝对生长率%0.27±0.02aA0.22±0.01bB0.23±0.03abAB0.26±0.03aAB0.25±0.02aAB0.24±0.02abAB0.24±0.03abAB瞬时增长率%0.0014±0.00010aA0.0012±0.00003bB0.0013±0.00014abAB0.0014±0.00014aAB0.0014±0.00008aAB0.0013±0.00010abAB0.0013±0.00012abAB存活率%100.00±0.00a92.22±1.92b93.34±5.77b94.44±1.93b93.33±0.00b93.33±3.34b93.33±3.34b注：同行相同字母表示无显著差异，不同小写字母表示差异显著(P0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P0.01)。从表3可以看出与正常组相比感染后鲤鱼的生长性能都有所下降，在日粮中添加枯草芽孢杆菌后感染鲤的生长性能有所提高，并呈现出对添加剂量的相关性，2组感染后没有饲喂芽孢杆菌鲤的丰满度、绝对生长率、瞬时增长率都是同期最小值，4组生长性能在感染组中同期最好。丰满度2组最低与其5、6组相比显著降低(P0.05)，其余各组间的差异不显著，5组丰满度数值为同期最大。2组的绝对生长率、瞬时增长率与3、6、7组无显著差异，但与4、5组相比显著降低(P0.05)，与1组相比极显著的降低(P0.01)。鲤感染荧光假单胞菌以后存活率显著下降(P0.05)，饲喂枯草芽孢杆菌对感染鲤存活率无明显影响。2.3肌肉基本成分指标表4肌肉基本营养成分指标Table4MusclenutrionalcompositionofCarp项目1234567粗蛋白%17.56±0.36aA16.02±0.26cB16.95±1.14abcAB17.53±0.44aA17.29±0.40abAB16.45±0.36bcAB16.48±0.47abcAB粗脂肪%2.31±0.02c2.54±0.04a2.51±0.03ab2.35±0.10bc2.40±0.09abc2.42±0.07abc2.53±0.03a水分%77.96±0.64b79.17±0.72a78.02±0.37b77.90±0.44b78.26±0.47ab78.60±0.30ab78.76±0.29ab粗灰分%1.83±0.031.85±0.041.88±0.011.81±0.061.85±0.041.92±0.021.88±0.03注：同列相同字母表示无显著差异，不同小写字母表示差异显著(P0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P0.01)。表4表明，与正常组比较感染鲤（2组）肌肉中粗蛋白含量极显著降低(P0.01)。在感染鲤日粮中添加不同剂量枯草芽孢杆菌后，3、4、5、6、7组鲤肌肉中粗蛋白含量均高于未添加组，除6组外均与正常组无显著差异，其中5组粗蛋白含量显著高于未饲喂组（2组）(P0.05)，4组极显著的高于2组(P0.01)，6组粗蛋白含量显著低于1、4组(P0.05)，其余各组间无显著差异。粗脂肪含量2、7组显著高于1、4组(P0.05)，3组粗脂肪含量显著高于1组(P0.05)，其余各组之间无显著差异。2组水分含量最高且显著高于1、3、4组，其余各组