不同地区桔梗多糖含量的比较

不同地区桔梗多糖含量的比较张小斌（商洛学院生物医药工程系、中国中医研究院商洛中药材GAP科研工程中心陕西商洛726000）摘要选取陕西商洛、安徽太和和吉林延边产桔梗，采用水提取法提取桔梗粗多糖，分别测定粗多糖含量，采用三氯乙酸－正丁醇法脱蛋白脱去多糖中粗蛋白，测定精制多糖含量，比较三个地区桔梗粗多糖及精制多糖含量。结果显示，安徽太和粗多糖含量最高，为26.36%，其次为吉林延边桔梗，为18.27%，陕西商洛桔梗为17.08%。提取粗多糖经精制后，安徽太和、陕西商洛、吉林延边桔梗粗多糖蛋白去除率分别为：74.27%，68.08%和69.36%，差异不显著。精制多糖含量分别为：12.61%，15.42%和11.42%。结果表明安徽太和桔梗多糖含量最高，陕西商洛次之，最后为吉林延边桔梗。关键词：桔梗；粗多糖；精制多糖；含量中图分类号：文献标识码：文章编号：ComparisonthecontentofpolysaccharideofplatycodoninthreeareasAbstract:Selecttheplatycodon,inshangluo,anhuitaiandjilininyanbianwithwatertoextracthecrudepolysaccharideofplatycodon,ahdthencrudepolysaccharideisdetermined,Usetheacid-n-buohthedifferentmethodtotakeofftheproteininthepolysaccharidecrude,andthentodeterminetherefinedpolysaccharide,comparethethickpolysaccharidesandrefinedpolysaccharideofplatycodoninthesethreeareas.Theresultisshowedthatthehighestcontentofpolysaccharideinanhuitai,thickfor26.36%,followedbyjilinyanbianballoonflower18.27%,theminimumisshangluoballoonflower,for17.08%..Aftertheextractionofrefinedpolysaccharidefromcrudepolysaccharide,theballoonflowerthickglycoproteinremovalrateinanhuitai,shangluo,jilinyanbianismorethanrespectively74.27%,68.08%and69.36%,thedifferenceisnotsignificant.Refinedpolysaccharideis12.61%，15.42%and11.42%,theresultsshowthatthecontentsofpolysaccharideinanhuitaiballoonflowerhighest,inshangluoisthesecondsmallest,andfinallyforjilinyanbianlisianthus.Keywords:platycodon;crudepolysaccharide;Refinedpolysaccharide;content1.1选题的目的桔梗[1](Platycodongrandiflorum(Jacq．)A．DC．)是桔梗科桔梗属、多年生草本植物,别名铃铛花、梗草、和尚头花、土人参、包袱花等。药用其根,为桔梗科植物桔梗的干燥根。我国最早药书《神农本草经》有记载,桔梗系常用中药桔梗花大美丽，可供观赏，种子可榨油，根是一种常见的中药材。其味苦、辛，性微温有宣肺、散寒、祛痰、排脓等功效，主治外感咳嗽、喉痹咽痛、胸满肋痛等症。现代医学认为，桔梗富含桔梗皂甙、多糖、甾醇类、萜类、桔梗酸等成分，并含有十几种氨基酸及铜、铁、锌、锰等22种微量元素，具有抗炎、止咳、化痰、抗溃疡、扩张血管、降血压、解热镇痛、镇静、降血糖、促进胆酸分泌、抗过敏等许多药理及保健功能[2]。除此以外，桔梗还可以作为蔬菜食用，在朝鲜、韩国、日本及我国东北地区，人们食用桔梗的习惯十分普遍。桔梗在我国分布较广，产于皖南山区、沿江丘陵地区及皖西大别山区，生于海拔1600米以下的山坡草地、灌丛中，苏联(西伯利亚)、日本也有。我省我市也有大规模种植：如商洛丹凤县等。桔梗是商洛产地道药材,野生或栽培均有。目前已形成了商洛桔梗规范化生产技术标准操作规程[3]。为提取桔梗有效中药成分，更好地利用这些植物资源，服务于地方经济建设，我们研究不同地区桔梗中多糖的提取及测定，为评价桔梗药材及新选育品种的质量提供方法，进一步用于生产实践打下基础。1.2选题的依据多糖广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果实、种子及动物细胞膜、微生物的细胞壁中，是由醛基和酮基通过苷键连接的高分子聚合物，也是构成生命的四大基本物质之一。它在自然界中来源广泛，特别是在高等植物、动物、微生物、地衣和海藻中含量丰富。多糖不但是生物体的主要结构成分，还具有复杂的多方面的生物活性与功能。大量研究巳表明：多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗过敏、抗氧化、抗衰老、抗病毒、降血糖等多种生物活性，且多糖药物毒副作用小、安全性高，在临床上得到广泛应用。近年来有关多糖的研究发展迅速，从动物、植物和微生物等各种生物材料中提取的多糖具有免疫调节、抗肿瘤、降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老、抗病毒等方面的生理活性，已成为热点研究领域。桔梗多糖是一种菊糖型多聚糖，可开发为保健饮料和具有抑菌保健作用的食用包装复合膜，是桔梗食用品质的主要评价指标。现代药理学研究发现桔梗多糖还具有多种生物活性，如免疫调节、祛痰、保肝、消炎、改善胰岛素、增强机体免疫功能及抗肿瘤等，具有广阔的开发前景。桔梗多糖的含量与很多因素有关，例如不同产地、不同部位、不同生长年限等，不同产地对桔梗多糖含量的影响关系到药材及新选育品种的质量。桔梗药用最早见于《神农本草经》，弓晓杰[4]等发现，桔梗提取物能促进肠促胰酶肽的分泌，可用于治疗胰腺炎。国内已经报导了不少关于植物多糖的提取方法及其抗氧化性的研究，如黄茋多糖[5]灵芝、枸杞复合多糖[6]等。桔梗多糖含量的测定也屡见不鲜，如李妍[7]的苯酚一硫酸法测定多糖含量，吴彦[8]的桔梗中多糖含量的提取及测定，贾林[9]的桔梗多糖的提取与纯化，张莲姬[10]桔梗多糖的提取方法及其抗氧化性的研究等。桔梗做药用常用根部，桔梗根可制成美味的菜肴,在朝鲜、韩国、日本及我国东北地区将桔梗作为食用蔬菜的习惯十分普遍[11]。桔梗根含多种皂苷,混合皂苷完全水解产生桔梗皂苷(platycodigenin)、远志酸(polygalacicacid)以及少量桔梗酸A，并分离出桔梗皂苷A、C、D。此外还含甾醇类化合物。桔梗水提取物具有明显的药理作用。桔梗具有祛痰与镇咳作用，桔梗煎剂1g/kg给麻醉犬灌服后，能显著增加呼吸道粘液分泌量，其强度与氯化铵相似。桔梗的根、根皮、茎、叶、花、果均有显著的祛痰作用[12]。桔梗水提取750mg/kg腹腔注射，在机械刺激豚鼠气管粘膜实验中，镇咳效果达60%[13]。桔梗具有抗炎作用，口服桔梗粗皂苷200mg/kg,对角叉菜胶及醋酸所致的大鼠足肿胀均有明显抑制作用。用做药物开发是一般用水提物，主要是防止醇提取物对儿童用药造成损害。桔梗水提取物具有抗肿瘤作用，桔梗菊粉给ICR系雌性小鼠于1W中间日灌胃，然后接种艾氏腹水癌细胞，接种于腹股沟后30d，每日口服或腹腔给予菊粉组分，测定当时肿瘤重量与对照组比较，其抑制效果达30%～40%。对腹水型肿瘤小鼠也有相同作用。桔梗水提取物可导致体外培养的人肺癌细胞A549生长抑制和凋亡，分子生物学的研究表明，桔梗水提取物引起的细胞凋亡机制与端粒酶活性的降低和Bc-2表达的下调有关[14]。国外近年对桔梗的研究主要集中在:韩国学者对多糖类成分进行了大量研究，发现桔梗多糖能激活促细胞分裂蛋白质酶活性。多糖具有降血糖的功能，UkaiShigeo等从一种银耳(KINJI)的子实体或菌丝体中提取出抗高血糖的酸性多糖。FujiiMakoto等从海藻类植物中提取出一种能够降低血糖水平的藻类多糖，并制成了以岩藻依聚糖(Fucoidan)为主要成分的保健食品，它可以显著提高人们的免疫功能。HondaYasuki等从西洋樱草属(Polyanthus)植物中获得一种具有良好的保湿、抗皱等作用的酸性杂多糖。SawaiYasuko等从石菖蒲(Acorusgram／neus)的根茎中分离得到的多糖可抑制黑色素的产生，具有抗炎、抗氧化作用，可用于黑变病的治疗，且因其具有良好的保湿作用，故又可作为化妆品的有效成分。Shimomura等从甲壳类动物的肉类降解产物中得到一种具有美容功效的酸性多糖。实验证明，此酸性多糖可抑制延缓衰老的透明质酸的分解，减少皮肤细纹和干裂，因而可作为美容食品和化妆品的有效成分。2材料、仪器及试剂2.1供试材料陕西商洛、安徽太和和吉林延边三个地区产的桔梗。商洛桔梗购自香菊大药房，太和桔梗购自北京同仁堂（亳州）药材基地，延边桔梗购自吉林省长春市中药市场。所有桔梗均为2011年当地生产，分三个批次进行采样。2.2仪器及试剂主要仪器：紫外分光光度计（722型）;恒温水浴锅（RE52-99型）上海亚荣生化仪器厂；真空泵(SHB-3型)郑州杜甫仪器厂;冷冻离心机(H-2050R型)长沙湘仪离心机仪器有限公司;旋转蒸发仪(HHS-11-2型)上海博迅实业有限医疗设备公司;多功能粉碎机（878-A型）常州国华电器有限公司;电冰箱。试剂：牛血清蛋白和考马斯亮蓝购自西安西安国安生物科技有限公司；硫酸、苯酚、葡萄糖、正丁醇、三氯乙酸等试剂均为分析纯，购自西安三浦化学试剂有限公司。3试验方法3.1桔梗粗多糖的提取不同地区桔梗根部---烘干、粉碎---热水浸提---抽滤去除残渣---蒸发浓缩---离心去杂质---浓缩液醇析过夜---粗多糖粉碎：采用粉碎机粉碎，过60目筛。水浴浸提：将样品按设计的料水比，浸提温度，浸提时间，置于150m1的三角锥瓶中用保鲜膜密封进行恒温水浴浸提。醇析：经处理后的浸提液蒸发浓缩至原体积的1／5，4000r／min离心20分钟，去除浓缩过程中出现的杂质沉淀。取上清液加入4倍体积95％乙醇，放置4℃条件下沉淀静置过夜。3.2桔梗粗多糖的精制桔梗粗多糖的精制主要进行脱蛋白处理，脱蛋白的方法采用三氯乙酸-正丁醇法脱蛋白法。将三氯乙酸和正丁醇按照体积比为1∶10混合配制成三氯乙酸－正丁醇混合试剂，将桔梗多糖提取液与三氯乙酸－正丁醇试剂按照体积比为1∶20置于锥形瓶中混合，在30℃下恒温振荡30min，4000r/min条件下离心20min，弃去沉淀，得澄清液并测定蛋白质和多糖含量。3.3桔梗提取物含量的测定3.3.1桔梗多糖含量的测定桔梗多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[18]测定桔梗多糖含量，以葡萄糖为对照品。配制标准溶液：精密称取105℃干燥到恒重的葡萄糖标准样品20mg,并置于500ml容量瓶。配制苯酚溶液：取苯酚200g，加铝片0.2g和碳酸氢钠0.2g,蒸馏收集182℃时的馏分，称取此馏分10g,加水150ml，置棕色瓶中，即得。标准曲线的制作：精密吸取标准品溶液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0ml，分别置于具塞试管中，各加蒸馏水使总体积为2.0ml,再分别加苯酚试液1ml,摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0ml,摇匀后放置10min,置沸水浴中加热15min,取出冷却至室温。在分光光度仪上于490nm处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。用葡萄糖标准品溶液作为对照样测定不同浓度葡萄糖溶液的吸光度，作出回归曲线，求出回归方程。待测样品液以同样的方法测吸光度，对照求值。3.3.2桔梗蛋白质含量的测定桔梗蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝染色法[19]，以牛