不同植物油脂对体外培养条件下培养液酶活及微生物活力的影响

不同植物油脂对体外培养条件下培养液酶活及微生物活力的影响摘要:本文旨在研究不同饱和程度的植物油脂对体外培养条件下培养液酶活及微生物活力的影响。试验以3头装有瘤胃瘘管的山羊提供瘤胃液，采用单因子试验设计，对照组不加油脂，试验组分别添加花生油、菜籽油、玉米油和豆油进行体外培养。结果表明:乳酸脱氢酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶3种酶的活性都以菜籽油组最高，豆油组、玉米油组、花生油组依次降低，除花生油组外，其他试验组均显著高于对照组(P＜0．05)，且试验组间存在显著差异(P＜0．05)。总脱氢酶以豆油组最高，显著高于对照组(P＜0．05)，并依次显著高于玉米油组、花生油组和菜籽油组(P＜0．05)。此外，油脂组原虫DNA、细菌DNA、微生物DNA、原虫/细菌区系比例的均值与对照组，以及试验组间差异均不显著(P＞0．05)，但随着培养时间的延长其动态变化模式不尽相同。微生物DNA在各时间点都以豆油组与玉米油组的较高;而原虫/细菌比例则以豆油组和玉米油组较低。综上所述，饱和程度不同的油脂对体外培养瘤胃微生物区系及其微生物细胞活力影响不同，其中以豆油促进微生物活力的效应最佳，玉米油较好。关键词:油脂;瘤胃微生物;转氨酶;脱氢酶;体外油脂作为能量饲料，对畜禽生产至关重要。但有报道认为，不饱和的油脂使用超过一定的量时，其降解产生的游离脂肪酸的不饱和键将会毒害瘤胃原虫和部分细菌，减少微生物的群体量并可能改变其群体结构，进而影响正常的微生物代谢与瘤胃发酵［1－2］。若能够借助油脂的这种负面效应，科学使用油脂，则可能达到在一定程度上抑制原虫群体量和其对细菌的吞噬力，进而增加细菌量、降低原虫与细菌区系比例、提高微生物生物总量，促进瘤胃发酵的效果。研究表明，各区系微生物(细菌、原虫、真菌和甲烷菌)因各自特点而对不饱和油脂的响应也不尽一致，如没有体壁的原虫对油脂较其他微生物为敏感［1］，本实验室前期对微生物微循环的研究也发现适量比例、且适当结构的油脂能够抑制原虫吞噬细菌的微生物再循环、增加了细菌生物量，对原虫和细菌区系有一定的控调效应［3］。因此，利用广泛易得、经济实用的油脂能量饲料作为瘤胃调控剂，增强瘤胃内酶和微生物活性、促进发酵，而最终实现饲料碳素、氮素的利用效率和宿主动物的生产力是可行而又实践意义的。关于油脂的研究多以影响瘤胃的微生物、发酵、甲烷产量等为主［4－6］，迄今尚未见关于影响微生物转氨酶、脱氢酶等细胞活力方面的研究报道。鉴于此，本试验拟选用4种植物油脂分别进行体外培养，测定体系中转氨酶、脱氢酶等的活性，以研究饱和程度不同的油脂对微生物细胞活力影响的规律和机制，为反刍动物瘤胃微生态调控技术的研究和实际生产中油脂的使用提供参考。动物营养学报23卷1材料与方法1．1试验动物与饲养管理在扬州大学农牧场选择3只1．5岁并装有瘤胃瘘管的徐淮白山羊，平均体重为(29．7±0．14)kg，用于采集瘤胃液。试验山羊分隔单舍，以玉米、豆粕和羊草为常规饲粮，于07:00和19:00分2次饲喂，自由饮水。1．2试验设计与培养底物试验采用单因子试验设计，共分5组，每组3重复。对照组不加油脂、试验组分别为花生油组、菜籽油组、玉米油组和豆油组。底物组成与油脂碘价见表1，棕榈酸钙为本实验室生产。表1底物组成与油脂碘价Table1Compositionofsubstratesandiodinevaluesofoil%项目Items对照组Controlgroup花生油组Peanutoilgroup菜籽油组Rapeseedoilgroup玉米油组Cornoilgroup豆油组Soybeanoilgroup碘价Iodinevalue淀粉Starch1919191919酪蛋白Casein1010101010纤维素Cellulose6767676767棕榈酸钙Calciumpalmitate4花生油Peanutoil494．1菜籽油Rapeseedoil4114．5玉米油Cornoil4131．3豆油Soybeanoil4143．7合计Total100100100100100碘价为实测值。Iodinevalueswereallmeasuredvalues．1．3体外培养与取样设计参考Menke等［7］的方法。配制好培养液(人工唾液盐∶瘤胃液=2∶1)，通入CO2，39℃水浴预热。按照试验设计准确称取2．0g底物置于培养瓶中，分别加入150mL培养液。通入CO2，39℃恒温水浴震荡培养。分别在培养后0、4、8、12、16、24h取样，每次取约15mL培养液，分装于3支离心管，其中1支立即离心并取上清液用于测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶的酶活;1支立即离心并用于测定总脱氢酶酶活;1只立即于－20℃冷冻保存，待分离微生物与微生物DNA的测定。1．4测定指标及方法1．4．1谷丙转氨酶、谷草转氨酶及乳酸脱氢酶测定各个时点取样后立即7000r/mim离心15min离心，并取上清液送江苏省苏北人民医院，采用全生化分析仪测定。1．4．2总脱氢酶活性测定参考Humeyan等［8］的方法，并略有改进。取100目尼龙布过滤的新鲜培养液2mL于试管中，加入0．2mL1．5%的氯化三苯四氮唑(TTC)反应，而对照管先加入5mL异丙醇抑制酶反应。在厌氧条件下恒温水浴(38～39℃)10min。试验组加入5mL异丙醇终止反应后，以4000r/mim离心10min。上清液稀释15倍，于分光光度计在485nm处比色。酶活单位定义为在38．5℃、pH6．8条件下，每分钟引起测定液吸光度上升0．1的酶量为1个酶活单位。酶活单位(U/mL)=(样品A485nm/min－对照A485nm/min)×15。1．4．3微生物分离与其DNA的测定依据差速离心原理分离微生物，具体步骤为:1)原虫:取瘤胃液加等体积生理盐水置于恒温(39℃)水浴锅中震荡(125r/min)水浴孵育60min，并辅以搅拌，再经4层纱布过滤，滤液离心(400r/mim离心10min)，收集沉淀为原虫，用生理盐水洗涤2次后用生理盐水悬浮，－20℃贮存待测。2)细菌:收集上述1)中离心后的上清液，再高速离心(15000r/mim离心15min)，收集沉淀为细菌，其余处理同1)中所述。微生物DNA测定原理:微生物体内DNA所占比例比RNA或蛋白质等成分更为恒定，利用微生物的DNA量来代表微生物的总量更加科学。DNA二苯胺显色后其595nm处的吸光度与样品13108期王曙等:不同植物油脂对体外培养条件下培养液酶活及微生物活力的影响中含量成线性关系，线性范围为40～400μg/mL，据此将待测样品释至线性范围内测定其光密度值、再据标准品测定得到的标准曲线即可查得样品浓度。微生物DNA测定采用二苯胺显色法并参照赵亚华［9］的步骤。制备小牛胸腺DNA钠盐(上海生工公司)标准溶液，制作以DNA量为横坐标，吸光度值为纵坐标的标准曲线。以样品的吸光度值从标准曲线上查出相对应DNA含量。1．5统计分析Excel整理数据和作图，用SPSSv16．0软件中comparemean的One-way-ANOVA过程进行方差分析和Tukey多重比较。2结果与分析2．1转氨酶及脱氢酶随时间的动态变化由表2和表3可见，培养液谷草转氨酶、谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶等随培养时间的延长大体上都不断提高，其中以菜籽油组变化幅度最大、豆油组次之，并且该2组持续在远高于对照组和其他油脂组的水平上变化;而玉米油组与花生油组与对照组接近，变化幅度不大。各个时间点比较，其中谷草转氨酶、谷丙转氨酶随时间变化的幅度较大，同一组的随时间变化有显著变化(P＜0．05);而乳酸脱氢酶随时间变化的幅度不大，同一组的各个时间点间没有显著差异(P＞0．05)。由表3可见，随着培养时间的延长，各组培养液总脱氢酶的活性有显著增长的趋势(P＜0．05)，除玉米组外，都以16h的该酶活性最高，而后又略有下降。各组间变化不尽一致，其中以豆油组增长幅度最大，其次依次为玉米油组、花生油组、对照组和菜籽油组，总体看来仅菜籽油组的总脱氢酶活性在培养过程中持续低于对照组。表2培养液中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性变化Table2TheactivitiesofGOTandGPTinculturesolutionIU/L项目Items时间Time/h0481624SEMP值P-value谷草转氨酶GOT对照组Controlgroup9．67±0．58b8．67±0．58b10．33±1．15b9．67±0．58b12．33±0．58a0．5960．001花生油组Peanutoilgroup14．33±1．15b15．33±0．58b14．00±1．00b16．33±0．58ab18．67±1．15a0．7600．001菜籽油组Rapeseedoilgroup107．00±2．65c108．67±2．31c107．33±4．62c123．33±5．86b142．67±4．51a3．4320．000玉米油组Cornoilgroup26．67±1．53b29．33±1．15b27．67±1．15b35．00±2．00a37．67±2．08a1．3330．000豆油组Soybeanoilgroup58．67±2．08c66．33±3．51b64．00±1．73bc65．33±1．52b72．33±1．15a1．7640．000谷丙转氨酶GPT对照组Controlgroup16．00±1．00b16．00±1．00b18．33±0．58ab17．00±1．00ab18．67±1．15a0．7890．017花生油组Peanutoilgroup24．00±1．73b24．67±1．53b24．00±1．00b25．33±0．58b29．67±1．53a1．0950．002菜籽油组Rapeseedoilgroup147．67±7．02c175．00±7．00b176．67±4．93b188．67±4．51ab201．33±8．08a5．2700．000玉米油组Cornoilgroup47．33±1．53b51．00±4．00b49．33±1．53b53．33±1．15b64．67±3．79a2．2010．000豆油组Soybeanoilgroup82．67±3．79c95．00±2．00b90．33±3．51bc93．67±2．08b102．00±2．64a2．3660．000同行数据肩标相同小写字母表示差异不显著(P＞0．05)，相邻小写字母表示差异显著(P＜0．05)，相间小写字母表示差异极显著(P＜0．01)。下表同。Inthesamerow，valueswiththesamesmalllettersuperscriptsmeannosignificantdifference(P＞0．05)，withadjacentsmalllettersuperscriptsmeansignificantdifference(P＜0．05)，whilewithalternatesmalllettersuperscriptsmeanextremelydif-ferent(P＜0．01)．Thesameasbelow．1311动物营养学报23卷表3培养液中乳酸脱氢酶和总脱氢酶的活性变化Table3TheactivitiesofLDHandtotaldehydrogenaseinculturesolution项目Items时间Time/h0481624SEMP值P-value乳酸脱氢酶LDH/(IU/L)对照组Controlgroup0．007±0．0060．003±0．0060．000±0．0000．007±0．0060．013±0．0150．0060．256花生油组Peanutoilgroup0．013±0．0060．010±0．0100．007±0．0060．007±0．0060．023±0．0060．0060．068菜籽油组Rapeseedoilgroup0．030±0．0020．023±0．0060．023±0．0060．033±0．0060．060±