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研究生培养手册学号：20112298姓名：赵强年级专业：2011级培养层次：硕士研究生导师：于翠梅职称：副教授学院：农学院沈阳农业大学研究生院制年月日说明一、本手册供研究生使用，毕业时归入本人学业档案。二、本手册是根据研究生培养的基本要求和有关规定而制订，研究生根据不同培养阶段填写有关内容。各学院可根据自身学科的特点，着重对某些项目的考核，亦可增加部分考核项目，以切实提高研究生的培养质量。三、本手册共有五个部分内容，第Ⅲ部分和第Ⅳ部分可根据需要增加附页。其中，“Ⅲ学位论文开题报告”部分可单独使用，中期考核后按要求装订成册，由学科统一报给研究生院。四、本手册2007年9月再版，自2006级研究生开始使用。各院系在使用过程中有好的意见和建议，望反馈给我们，以便再版及时补充和完善。五、本手册由自研究生在“研究生教育网”自行下载。沈阳农业大学研究生院二00七年十月研究生培养手册材料之一：基本情况1Ⅰ基本情况Ⅰ-1研究生一般情况姓名赵强性别男出生日期19870701学号20112298贯籍辽宁盘锦民族满政治面貌团员语种汉语入学年月2011专业遗传学研究方向遗传学是否同等学力否培养类型□非定向□定向□委培□自筹学历2010年6月毕业于沈阳师范大学大学（学院）生物技术专业入学前工作单位沈阳师范大学化学与生命科学学院生物技术家庭地址及邮编身份证号码联系方式15998269009Ⅰ-2研究生指导小组成员成员姓名分工职称单位备注导师于翠梅指导教师副教授沈阳农业大学农学院Ⅰ-3学籍变动记载序号种类起止日期说明1234说明：学籍变动种类包括休学、复学、保留学籍、联合培养、转专业、转导师、提前毕业、延迟毕业、退学研究生培养手册材料之二：课程学习计划2Ⅱ课程学习计划课程类别课程编号课程名称学分学期任课教师职称考核方式123456公共课自然辩证法2.5是康贝贝考试硕士英语12是李晓敏考试硕士英语口语11是外教I考试硕士英语Ⅱ2是李晓敏考试硕士英语口语Ⅱ科学社会主义理论与实践11.5是是外教II考试考试学位课选修课分子遗传学（含实验）3是郭玉华考试普通光学显微技术2.5是曹秀云考试数量遗传学3是吕文彦考试细胞遗传学（含实验）3是于翠梅考试作物分子育种理论与实验技术2是于翠梅考试农学院硕士专业外语1是考试高级植物生理实验技术3是考试生态学研究法3是赵天宏考试作物生物实验技术2是于翠梅考试补硕（本）课学分合计32.5说明：根据培养方案要求，结合研究生本人基础及研究方向等条件制定课程学习计划。研究生培养手册材料之三：学位论文开题报告3-1Ⅲ学位论文开题报告学生姓名赵强学号20112298导师姓名于翠梅课题名称不同类型大豆品种转化的研究Ⅲ-1选题依据（课题研究的目的、意义，国内外研究现状分析，附主要参考文献）一、课题研究的目的、意义大豆是我国重要的粮食、油料和饲料作物，以往大豆新品种的培育主要以常规育种为主。然而，大豆常规育种技术存在育种年限长、难以打破性状连锁、多基因重组率低、远缘杂交困难等问题。近20年来所发展起来的生物技术却很好地弥补了传统育种的不足之处。自从1983年第一次获得转基因植物以来，利用生物遗传转化技术，把诸如高产量、抗虫性、抗除草剂、提高蛋白质和油脂含量等优良性状转至大豆，一直被认为是育种工作研究的重要课题之一。大量的研究表明，不同类型的大豆品种在转化效率和再生能力上存在很大差异。本实验的目的在于对不同类型的大豆品种进行转化，从而研究影响大豆转化的因素。二、国内外研究现状分析目前大豆进行遗传转化的方法主要有花粉管导入法、根癌农杆菌介导法、基因枪法、真空抽滤法和超声波辅助农杆菌方法等，其中的基因枪法和根癌农杆菌介导法被广泛应用，但却存在着一些缺陷：1、大豆植物组织培养再生体系还不完善，再生频率较低。已经报道获得的再生大豆植株多为嵌合体，对于基因转化检测带来诸多困难，而要获得纯合体必须进行有性杂交选择，这样不但增加了成本而且延长了选育周期2、大豆转化的频率仍很低，一般为1.0%-2.0%，重复性亦很低，还远未模式化转化再生的水平。目前农杆菌介导的转基因方法是大豆进行基因转化最简便、最经济的方法之一，其Ti质粒可以将外源基因整合到植物染色体，并使之与植物内源基因同步表达，从而建立高效、稳定的大豆再生体系。大豆子叶节不定芽器官发生体系因具有取材不受季节限制、诱导率高、生长快、不易发生变异、再生植株健壮易成活等优点，而成为大豆基因工程的一种较为理想的材料。但是子叶节再生体系也存在诸如丛生芽的相互抑制，不易伸长，再生困难等缺点。研究生培养手册材料之三：学位论文开题报告3-2三、主要参考文献[1]袁鹰,刘德璞,郑培和,等.大豆组织培养再生植株的研究[J].大豆科学,2001,20(1):9-12.[2]刘金华,王丕武，等.大豆子叶节丛生芽的诱导[J].吉林农业大学学报，2001,23(4):15-17[3]孙昕，闫帆，赵健如等.大豆子叶节丛生芽的诱导研究[J].大豆科学，2012,31(2):184-188王萍，王罡，吴颖，等．大豆组织培养的研究进展[J].大豆科学，2003，22(2):142-145[4]曹荣，芦琳琳，朱保葛．“小粒黄”大豆子叶节丛生芽的诱导[J].大豆科学，2010，29(5):747-750[5]孙明杰，魏玄，邹丹丹，等．大豆子叶节高频愈伤组织诱导及其植株再生[J].大豆科学2011,30(4）:546-551[6]刘北东，朱延明，李海燕，等．大豆子叶节再生影响因素的研究[J].大豆科学，2002，21（2）:88-92[7]李桂兰，乔亚科，杨少辉，等．农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的研究[J].作物学报2005,31（2）:170-176[8]卫志明,许智宏，大豆顶芽组织培养植株再生的研究[J].植物生理学通讯,1988(3):17-20�[9]刘莉,赵桂兰，大豆子叶节组织培养再生研究[J].吉林农业科学，1999,24(5):16-20[10]赖冰冰,韩阳,李春风大豆子叶节植株再生体系的研究[J].大豆科学学,2011,30(2):303-305[11]邓向阳,卫志明.大豆转化技术[J].植物生理学通迅,l998,34(5):381-387[12]李军,李霞,陈杭.大豆茎尖离体培养再生植株[J].植物生理学通讯,2001,37(2):134[13]郝荣华，邵群，杨素欣，等.根癌农杆菌介导的大豆子叶节转化体系的优化[J].大豆科学学,2012,30(2)：167-172[14]马丽萍，张辉．一种快速、高效的大豆农杆菌转化技术[J].中国农业科学，2008，41(3):661-668．[15]林树柱，曹越平.卫志明.根癌农杆菌介导的大豆遗传转化[J］.生物工程学报，2004，20(6):817-820研究生培养手册材料之三：学位论文开题报告3-3[16]王振华，杨德光，张辉，等.大豆遗传转化技术在转基因大豆研究中的应用[J］．生物技术通报,2010(10):60-66．[17]于洋，侯文胜，韩天富.农杆菌介导大豆遗传转化技术的研究进展[J］．大豆科学，2010,29(4):696-701Ⅲ-2研究方案Ⅲ-2-1研究目标、研究内容和拟解决的关键问题：一、研究目标对不同类型的大豆品种（如高脂肪、高蛋白、高抗性）进行农杆菌侵染实验，检测比较不同类型的大豆品种之间的转化率的差异，寻找影响大豆转化的因素二、研究内容大豆子叶节不定芽器官发生体系因具有取材不受季节限制、诱导率高、生长快、不易发生变异、等优点，而成为大豆基因工程的一种较为理想的材料。本实验通过对不同类型的大豆品种的子叶节进行农杆菌侵染实验，检测比较不同类型的大豆品种之间的转化率的差异三、拟解决的关键问题1.子叶节再生体系也存在诸如丛生芽的相互抑制，不易伸长，再生困难等问题2.丛生芽中真的转化苗不易在早期筛选出来，得到的丛生芽中假阳性比例太高，须经GUS染色检测方能辨别，实验周期长3.控制无菌操作过程中染菌的情况，严格控制培养条件研究生培养手册材料之三：学位论文开题报告3-4Ⅲ-2-2针对研究内容拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析一、研究方法采用不同类型的大豆品种，以子叶节为外植体，进行农杆菌介导的转基因实验，比较其不同的转化率，寻找影响大豆转化的因素。二、技术路线三、实验方案1.实验材料：选取不同类型的大豆品种2.培养基：①萌发培养基：GM②共培养培养基：CCM③诱导发芽培养基：SIM④伸长培养基：SEM⑤生根培养基：RM⑥培养菌培养基：YEP3.灭菌方法：培养皿内放入大豆，小烧杯内放入消毒液，放入干燥器中，置于通风橱内，灭菌18小时，后用封口膜封住培养皿，消毒液：50ml漂白水+2ml浓HCl。4.大豆的萌发：取灭过菌的大豆，置于GM培养基内，接种大豆12-16粒，22-23℃黑暗培养16h(过夜培养)。5.接菌小量：用YEP作为培养液，以Kan和Rif作为真菌的抑制剂，28℃×180r/h×24h，振荡培养。6.接菌(大量)：YEP培养液，加入Kan和小量菌液，180r/h×28℃摇床摇晃培养12-16h，至600nm下OD值为0.5-1之间。7.侵染大豆：菌液在共培养之前，菌液在600nm下OD值达到0.5-1之后，25℃3500r/min×10min离心菌液，取沉淀，然后两个离心管内加入共培养液（CCM）平均，振荡，至全部溶解；切豆，切开时，在子叶结上轻轻用刀划几下，划割时候用实验刀片沾取一下菌液；共培养，30min×126r/h×28℃；取出共培养的大豆，子叶向上，置于铺有一层滤纸的共培养基上，每个培养皿内放10粒，22℃黑暗培养3-5天。8.诱导产生丛生芽：切掉过长的大豆的芽，留大约5-10mm，45°斜插入到培养基（SIM)中，26℃光照培养14天，14天后切去过长的丛生芽，更换新的培养基进行诱导发芽选取大豆灭菌检测转化率伸长培养筛选转化苗诱导产生丛生芽大豆与农杆菌共培养大豆萌发研究生培养手册材料之三：学位论文开题报告3-5Ⅲ-2-4研究进度、工作内容和预期成果2011.09-2012.03学习试验中需要的基础知识，完成研究生学习过程中所必须的课程2012.03-2012.12选取不同的类型的大豆品种进行转化，观察转化过程和转化情况2013.02-2013.12比较不同类型的大豆的转化，测量一些需要补充的数据（这时需加入PPT草胺磷筛选剂），培养14天，每皿10个，经过筛选，得到的是转化后和假阳性的丛生芽。9.伸长：将诱导两次的外植体，切去过长的芽、子叶和下胚轴，在外植体的下端切出一个伤口，置于伸长培养基中，每皿7个，26℃光照培养，每14天继代一次，得到的伸长的丛生芽上去一两片叶子，进行GUS染色，检测转化情况。10.生根：当外植体伸长出苗到足够长时，转入到生根培养基中，诱导生根苗转入生根培养基10天，未生根而成长出愈伤组织的切去底端，插入到新的生根培养基中。11.炼苗：向瓶中倒入适量的无菌水，然后用三层无菌纱布封住瓶口，每天揭去一层，第三天移栽，光照（5灯管。26-27℃）。12.移栽：当苗的根足够丰富，将苗移入土中，确保有足够的温度和湿度。13.比较不同类型的大豆品种的转化情况四、可行性分析一批大豆从萌发，转化，诱导，产生幼苗的时间周期大约为2个月，试验时间上可以完成该实验，选取的不同类型的大豆品种作为转化的检测材料，为前人没有完成过的。Ⅲ-2-3本课题的特点与创新之处本实验采取不同类型的大豆品种，进行农杆菌侵染实验，以大豆的子叶节作为外植体和侵染的对象，诱导产生丛生芽，对丛生芽的数量，生长情况做详细的记录和分析，比较不同类型的大豆品种的转化过程，包括，转化率，转化得到的丛生芽的数量，状态，比较不同类型的大豆品种之间的转化过程和结果，寻求影响大豆转化的因素。研究生培养手册材料之三：学位论文开题报告3-62012.01-2014.04完成毕业论文，提交论文审核的材料，准备答辩2014.04-2014.06完成答辩和学校的要求，顺利毕业Ⅲ-3经费预算支出科目金额(万元)计算根据及理由论文课题调研费实验材料费仪器设备费学位论文答辩支出科目按下