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PCR产物测序实验操作流程一、实验试剂和耗材准备（一）实验试剂实验试剂主要用途核酸提取试剂盒主要用于DNA或RNA的提取（详细步骤参考相应说明书）上、下游引物PCR或测序反应ExtenderPCR-to-GelMasterMix，2×PCRddH2OPCR、测序反应及其它用途核酸荧光染料(4sGreen)琼脂糖凝胶电泳DNAMarker琼脂糖凝胶电泳TBE电泳缓冲液琼脂糖凝胶电泳琼脂糖琼脂糖凝胶电泳核酸外切酶I(ExoI)PCR产物的纯化碱性磷酸酶(ALP)PCR产物的纯化经纯化后的PCR产物测序反应BigDyev3.1测序反应100%酒精测序产物纯化125mMEDTA（PH=8）测序产物纯化70%酒精测序产物纯化POP7胶上机测序过程（毛细管电泳）Hi-Di甲酰胺上机测序过程（毛细管电泳）毛细管电泳Buffer上机测序过程（毛细管电泳）SequenceStandard（3500）测序标准品（阳性对照）（二）、实验耗材实验耗材主要用途1.5mlEP管各种试剂的分装、盛放、储存等1.5mlEP管支架1.5ml或2mlEP管的支撑或存放0.2mlPCR管PCR八连管及八连管盖PCR96孔板PCR、测序反应及上机测序各种规格微量移液器微量试剂的定量和移取各种规格移液器吸头配合移液器的使用（吸附试剂）96孔板支架固定和支撑96孔板、八连管以及PCR单管96孔板封垫封板用封板滚轮封板用冰维持待反应试剂低温环境各种规格量筒溶液的稀释或试剂的配置锥形瓶琼脂糖凝胶的熔化容量瓶溶液的稀释与试剂的配置药匙和称量纸试剂的称量凝胶槽和凝胶梳琼脂糖凝胶的凝固和加样孔的形成计时器计时记号笔做各种记号或标记一次性手套防污染和保护作用铝箔封96孔板二、实验仪器实验仪器主要用途制冰机制冰电冰箱试剂的储存高速台式离心机试剂的离心Mini式离心机瞬离试剂旋涡式混合振荡器混匀试剂电子分析天平试剂的称量核酸检测仪核酸纯度和浓度的检测PCR仪PCR电泳仪和水平电泳槽琼脂糖凝胶电泳凝胶成像仪核酸琼脂糖凝胶电泳的检测和分析基因分析仪DNA的测序或片段分析蒸汽式高压湿热消毒器试剂、实验耗材及用具的消毒电热鼓风干燥箱实验用品的干燥恒温水浴锅提供恒温环境三、实验操作具体步骤（一）核酸的提取按照DNA或RNA提取试剂盒操作（具体操作步骤参考试剂盒操作说明书），如是RNA需进一步反转录为cDNA。-20℃保存备用。（二）测序PCR模板的制备（1）、预先制备适量冰（2）、在冰上融化模板DNA、引物以及ExtenderPCR-to-GelMasterMix（3）、按照以下反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上成分体积（20µl体系）终浓度ExtenderPCR-to-GelMasterMix，2×10µl1×10µM上游引物0.5-2µl0.25-1µM10µM下游引物0.5-2µl0.25-1µM50ng/µl的模板0.1-1µl5-50ngddH2O根据需要—（4）将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序95℃5min→（95℃30sec，67℃30sec-0.5℃/循环，72℃1min）x14循环→（95℃30sec，57℃30sec，72℃1min）x30循环→72℃7min→4℃Forever（5）琼脂糖凝胶电泳检测:量取适量1×TBE缓冲液并称取一定量琼脂粉溶于其中制成1%-2%的琼脂糖凝胶，在微波炉上加热溶化，待温度降至60℃-70℃左右加入荧光染料，温度降至40℃-50℃左右将琼脂粉溶液倒入插有梳子的凝胶槽中冷却，待凝胶完全凝固备用。将凝胶置于水平电泳槽中，取少量PCR产物上样电泳，将电泳好的样品置于凝胶成像系统中进行检测和分析。（6）将检测合格的PCR产物用酶解法进行纯化。根据核酸外切酶I(ExoI)，碱性磷酸酶(AIP)的作用浓度，加入到PCR反应产物中，37℃消化15min，85℃使酶失活15min。纯化体系如下：PCR产物5µlExoI0.5µl碱性磷酸酶1µl（三）、纯化后的PCR产物的测序反应1、纯化后的PCR产物按照1:3~1:6稀释（若琼脂糖凝胶电泳条带非常亮，可以适当增大稀释倍数）2、测序反应用引物稀释到1µM（1）PCR产物测序反应体系（10µl）：成分加入量纯化并稀释好的PCR产物1µl（也可参考下表）引物（上游或者下游）1µM1µlBigDye(2.5x)10倍稀释8µl总体积10µlPCR产物测序体系中PCR产物的加入量如下表：DNA纯度：OD260/OD280=1.6~1.8；DNA含量（ng/µl）=OD260×50PCR产物片段大小加入量100-200bp1-3ng200-500bp3-10ng500-1000bp5-20ng1000-2000bp10-40ng2000bp以上20-50ngBigDye（2.5x）稀释10倍配方：成分加入量BigDye（2.5x）50ulSeqBuffer225ulddH2O725ul（2）测序PCR循环条件：一般测序：96°C1min→(96°C10sec→50°C5sec→60°C4min)x25循环→4°C保温大分子测序：95°C5min→(96°C30sec→50-55°C10sec→60°C4min)x50循环→4°C保温（三）测序反应产物纯化（酒精/EDTA法）：1、96孔板纯化方法：（1）每管加入2.5μL125mMEDTA(pH=8)，加到管底；（2）加入30μL100%酒精，封严，震荡4次，室温放置15min；20°C最大转速离心45min，马上倒置96孔板，倒置最小转速离心10s；（3）加入60μL70%酒精，最大转速4°C离心15min，马上倒置96孔板，最小转速离心1min；（4）70%酒精重复洗涤1次或2次；（5）让残余的酒精在室温挥发干，加入10μLHi-Di甲酰胺，95°C变性4min，迅速置冰上4min，上样电泳。2、单个0.2mL离心管离心方法：（1）每孔加入2.5μL125mMEDTA到溶液中，再加入30μL100%酒精，盖好，震荡4次，室温15min。（2）台式离心机12000xg离心30min，马上用枪吸尽上清液。（3）每孔加入60μL70%酒精，12000xg4°C离心15min，马上用枪吸尽上清液。此步可以重复1次。（4）让酒精在室温挥发干净，加入10μLHi-DiFormamide溶解DNA。（5）在PCR仪上变性：95°C4min，4°C4min。上机电泳。一般常见的纯化方式有三种：（1）酒精/EDTA沉淀法：利用EDTA螯合定序反应中的Mg2+离子，再加入酒精，经离心后使定序产物小片段沉淀，游离的荧光物质则悬浮于上清液中，小心地将上清液除去，再经过一次的酒精清洗沉淀物，则可以完全去除游离的荧光物质。此法的优点是可以将游离的荧光物质去除的非常干净，几乎完全没有背景值会影响序列判读，然而，其缺点是无法保留小分子量的片段，约第20个碱基开始才可以被读取出来。（2）酒精/EDTA/醋酸钠沉淀法：利用EDTA螯合定序反应中的Mg2+离子，再依序加入醋酸钠（帮助沉淀）、酒精，经离心后使定序产物小片段沉淀，游离的荧光物质则悬浮于上清液中，小心地将上清液除去，再经过一次的酒精清洗沉淀物，则可以去除游离的荧光物质。此法的优点是可以保留住极小分子量的片段，使第一个碱基就可以被读取出来，然而，其缺点是无法完全去除游离的荧光物质，会有较高的背景值影响序列判读。（3）离心管柱纯化法：使用特殊的gel-filter，将定序反应产物小心地注入其中，经过低速离心，游离的荧光物会保留在gel中，流出液则完全不含游离的荧光物。此法的优点是结合前面两种方法的优点--既可以读取到第一个碱基，背景值也完全被清除干净，也相当省时（只需7分钟，前面2种方法约需1小时），然而，其缺点是昂贵。