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专题5DNA和蛋白质技术课题3血红蛋白的提取和分离一、学习目标：本课题尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法，电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。二、重点：[来源:学&科&网]凝胶色谱法的原理和方法三、难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。【基础梳理】一、凝胶色谱法1、概念：也称做；是根据分离蛋白质的有效方法。2、原理（1）由构成的凝胶，内部有许多贯穿的的。（2）当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程，移动速度，而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度，从而使不同的蛋白质分子得以分离。二、缓冲溶液1、作用：在一定范围内，抵制的对溶液pH的影响，维持pH。2、配制：由种缓冲剂溶解于中配制而成，通过调节缓冲剂的就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。三、电泳[来源:Zxxk.Com]1、概念：指在电厂的作用下发生的过程。[来源:学科网ZXXK]2、原理：在一定的下，、等生物大分子的可解离基团会带上或，在的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动。3、作用：电泳利用了待分离样品中各种分子的差异及分子本身的、的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中的分离。4、方法：常用的电泳方法有和。测定蛋白质分子量时通常使用。四、实验操作1、样品处理:通过、、等操作收集血红蛋白溶液。(1)红细胞的洗涤：目的是。分离时采取，直至上清液中没有，表明红细胞已洗涤干净。[来源:学+科+网Z+X+X+K](2)血红蛋白的释放：在和的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：把离心后，将试管中的液体用过滤、除去，于中静置片刻后，分离出下层的。[来源:学科网ZXXK]2、粗分离：即透析(1)方法：将血红蛋白溶液装入，将放入一定量适宜浓度的中，透析。[来源:Z#xx#k.Com](2)目的：将的杂质除去。(3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。3、纯化:通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下：(1)凝胶色谱柱的制作。(2)凝胶色谱柱的装填①材料：本实验使用的是。②方法：凝胶用充分溶胀后。配成，一次性倒人色谱柱内。不能有存在；不能发生流干露出凝胶颗粒的现象。(3)样品的加入和洗脱①a、准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的缓慢下降到与平齐，关闭出口。b、加样：用小心地将1mL透析后的样品加到的顶端，注意不要破坏。c、加样后：打开下端出口，使样品渗入内。②洗脱：加入，打开下端出口，进行。4、纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是。五、操作提示1、红细胞的洗涤：、与十分重要。过少，无法除去血浆蛋白；过高和过长会使等一同沉淀，达不到分离效果。[来源:学.科.网Z.X.X.K]2、色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在中膨胀，可以将加入其中的用加热，加速膨胀。3、凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的，降低。4、蛋白质的分离：如果红色区带地移动，说明色谱柱制作成功。1使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中,相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程,可表示为图中()。2关于凝胶色谱柱的装填,除哪项外均为正确解释()。A.交联葡聚糖凝胶(SephadxG75)“G”表示凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围,75表示凝胶得水值B.色谱柱内不能有气泡存在,一旦发现有气泡,必须重装C.用300mL物质的量浓度为20mmol·L-1的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12hD.凝胶用自来水充分溶胀后,配成凝胶悬浮液3下列对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作,不正确的是()。A.加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐B.让吸管管口沿管壁环绕移动,贴壁加样至色谱柱顶端,不要破坏凝胶面C.打开下端出口,待样品完全进入凝胶层后,直接连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱D.待红色的蛋白质接近色谱柱底端时,每5mL收集一管,连续收集流出液4使用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺电泳过程中,不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于()。A.电荷的多少B.分子的大小C.肽链的多少D.分子形状的差异5凝胶色谱分离法分离蛋白质时,凝胶的种类较多,但其作用的共同点是()。A.改变蛋白质分子通过凝胶时的路径B.吸附一部分蛋白质,从而影响蛋白质分子的移动速度C.将酶或细胞固定在凝胶中D.与蛋白质分子进行化学反应,从而影响其移动速度6将经处理破裂后的红细胞混合液以2000r·min-1的速度离心10min后,离心管中的溶液分为四层,从上到下的顺序依次是()。A.血红蛋白、甲苯层、脂溶性物质层、沉淀层B.甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂溶性物质层C.脂溶性物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层D.甲苯层、脂溶性物质层、血红蛋白、沉淀层7(2011·江苏南通期末)下列关于血红蛋白提取和分离实验中样品处理步骤的描述,正确的是()。A.红细胞的洗涤:加入蒸馏水,缓慢搅拌,低速短时间离心B.血红蛋白的释放:加入生理盐水和甲苯,置于磁力搅拌器上充分搅拌C.分离血红蛋白:将搅拌好的混合液离心、过滤后,用分液漏斗分离D.透析:将血红蛋白溶液装入透析袋,置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12h8在血红蛋白的整个提取过程中,不断用磷酸缓冲液处理的目的是()。A.防止血红蛋白被氧化B.血红蛋白是一种两性物质,需要酸中和C.磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程D.让血红蛋白处在稳定的pH范围内,维持其结构和功能9下面说法不正确的是()。A.在一定范围内,缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响,维持pH基本不变B.缓冲溶液通常由1~2种缓冲剂溶解于水中配制而成C.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程D.透析袋能使大分子自由进出,而将小分子保留在袋内10蛋白质的分离与纯化技术是蛋白质研究的重要技术。下列有关叙述不正确的是()。A.根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性,可将样品中各种不同的蛋白质分离B.根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小等,可通过电泳分离蛋白质C.根据蛋白质相对分子质量的大小,可通过凝胶色谱法分离蛋白质D.根据蛋白质的分子大小、密度不同,可通过离心沉降法分离蛋白质11．用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的蛋白质()A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快12．凝胶色谱分离法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是()A．改变蛋白质分子通过凝胶时的路径B．吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度C．将酶或细胞固定在凝胶中D．与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度13．相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的分离过程可表示为下图中哪一个()14．血红蛋白的提取和分离一般分为四步，符合要求的是()A．粗分离→样品处理→纯化→纯度鉴定B．粗分离→纯化→样品处理→纯度鉴定C．样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定D．纯化→纯度鉴定→粗分离→样品处理15．样品的加入和洗脱的操作不．正确的是()A．加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶柱内C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D．用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面16．使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于()A．电荷的多少B．分子的大小C．肽链的多少D．分子形状的差异17．(2011·广东高考)以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不．正确的是()A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢二、非选择题(共18分)18测定蛋白质的相对分子质量是研究蛋白质的一项重要技术。常用的测定方法是凝胶色谱法。请回答下列问题。(1)凝胶色谱法的原理是。(2)还有同学将大肠杆菌破碎并提取得到大肠杆菌蛋白质,一同学利用琼脂糖凝胶电泳技术将得到的蛋白质进行分离,在电泳过程中,影响蛋白质迁移速度的因素包括蛋白质分子的,分子的大小、形状等。而另一位同学则利用凝胶过滤法分离蛋白质。待蛋白质接近凝胶色谱柱底端时,用试管连续收集流出液。先收集到的蛋白质与后收集到的蛋白质的区别是。19凝胶色谱技术是20世纪60年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术,由于设备简单、操作方便,不需要有机溶剂,对高分子物质有很高的分离效果,目前已经被广泛应用于多个领域,请回答问题。(1)若选用SephadexG100,则G表示。(2)通过凝胶色谱法可将从红细胞中分离出的血红蛋白样品进一步,在血红蛋白的提取和分离实验中有以下操作,试回答:①实验时要对采集到的血液中的红细胞进行洗涤,洗涤的目的是。②在的作用下,红细胞会破裂释放出血红蛋白。③将释放出的血红蛋白收集到透析袋中透析,这是样品的,而透析的目的是。④实验最后经过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行。(3)装填凝胶色谱柱时,要注意色谱柱内不能有气泡存在,一旦发现气泡必须重装。这是因为解析:本题考查血红蛋白的分离和提取。血红蛋白分离和提取实验的操作分为样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定四步。整个实验的原理是依据蛋白质的各种特性分离蛋白质。20随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因测序工作的完成,人类跨入了蛋白质时代。对蛋白质的研究和应用,首先需要获得高纯度的蛋白质。请回答下列问题。(1)蛋白质的提取和分离一般分为四步:、、和纯度鉴定。(2)如果要从红细胞中分离出血红蛋白,实验前取新鲜血液要在采血容器中预先加入柠檬酸钠,这样做的目的是。(3)血红蛋白的提取又可以细分为:红细胞的洗涤、、分离血红蛋白溶液和。其中分离血红蛋白溶液时需要用到(仪器)分出下层的红色透明液体。