一般毒性作用试验.

1/9/20201一般毒性作用试验1/9/20202一般毒性毒性§1急性毒性作用§2蓄积毒性§3亚慢性和慢性毒性作用§4局部毒性作用1/9/20203§1急性毒性作用一、急性毒性和急性毒性试验的目的二、急性毒性试验三、急性毒性分级1/9/20204一、急性毒性和急性毒性试验的目的急性毒性(acutetoxicity)是指机体(人或试验动物)一次接触或24小时内多次接触化学物后在短期(最长到14天)内所发生的毒性效应，包括一般行为、外观改变、大体形态变化以及死亡效应。急性毒性作用1/9/20205一、急性毒性和急性毒性试验的目的目的①测试和求出化学毒物对一种或几种试验动物的致死量(以LD50表示)以及其它的急性毒性参数，了解急性毒作用强度。②并通过观察动物中毒表现和死亡的情况，了解急性毒作用性质、可能的靶器官和致死原因，提供化学毒物的急性中毒资料、初步评价对人体产生损害的危险性。③探求化学毒物急性毒性的剂量—反应关系与中毒特征。④为亚慢性、慢性毒性作用试验的染毒剂量设计提供参考依据。⑤研究化学毒物急性中毒的预防和急救治疗措施。⑥为毒理学机制研究提供线索。1/9/20206一、急性毒性和急性毒性试验的目的急性毒性试验常用的毒性参数：LD50/LC50Zac（LD50/Limac）LD84/LD16(或LC84／LC16)剂量—反应曲线斜率急性毒性作用1/9/20207二、急性毒性试验的主要步骤健康动物的选择性别辨认动物称重、编号和分组剂量设置受试物的配制灌胃中毒体征和动物死亡情况观察LD50的计算1/9/20208二、急性毒性试验(一)试验动物[原则]：①急性毒性试验要求选择对化学毒物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致的试验动物。②动物易于获得③品系纯化④价格较低和易于饲养等条件。1/9/20209二、急性毒性试验1．试验动物的种属和品系最好用两种种属的动物啮齿类:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔非啮齿类：狗或猴。急性皮肤毒性试验可选用成年大鼠、豚鼠或家兔，优先考虑白色家兔。而急性吸入毒性试验和经口急性毒性试验则优先考虑大鼠。急性毒性作用1/9/202010二、急性毒性试验⒉试验动物的年龄和体重：急性试验动物不宜过老或过幼，通常要求选择刚成年动物进行试验，而且须是未曾交配和受孕的动物。例如：大鼠180～240g、小鼠18～25g、家兔2～2.5kg、豚鼠200～250g、狗10～15kg。同一批试验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的20％。急性毒性作用1/9/202011三、急性毒性试验3.试验动物的性别：急性毒性试验的主要内容是求LD50，除特殊要求外，一般急性毒性试验对动物性别要求为雌雄各半。如果在预试验时发现化学毒物(如农药)对雌、雄动物毒效应的敏感性有明显差异，则应单独分别求出雌性与雄性动物各自的LD50。如果试验是为致畸试验作准备，也可仅作雌性动物的LD50测试。急性毒性作用1/9/202012二、急性毒性试验4.动物数量与随机分组：大、小鼠等小动物每组10只狗等大动物每组6只分组原则——随机化原则5.禁食：经消化道染毒时，要求试验前对动物禁食大鼠、小鼠——隔夜进食；染毒后禁食4h大动物——每日上午喂食前染毒染毒后继续禁食2~4h，但在禁食时要保障饮水。6.实验动物的预检：选择健康动物1~2周的检疫期急性毒性作用1/9/202013二、急性毒性试验（二）试验动物的饲养环境恒定的温度：22±3℃湿度：30~70%照度：昼夜各半饲料合格、饮水合格、垫料合格急性毒性作用1/9/202014二、急性毒性试验（三）染毒途径的选择:染毒途径（exposureroutes）的选择需考虑：模拟人在生活和生产环境中实际接触受试物的途径和方式；有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较；受试物的性质和用途；各种受试物毒性评价程序的要求等。最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。急性毒性作用1/9/202015二、急性毒性试验经口(胃肠道)接触:灌胃:小鼠0.21.0ml/只或0.10.5ml/10g大鼠一次灌胃体积不超过5ml/只家兔不超过10ml/2kg狗不超过50ml/10kg吞咽胶囊:经呼吸道接触:静式吸入动式吸入经皮肤接触:注射途径接触:急性毒性作用1/9/202016二、急性毒性试验（四）染毒剂量与分组:1．查阅文献①了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压下的状态、熔点、沸点、密度、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等理化特性，生产批号及纯度，杂质成分与含量等。②确定使用哪一种计算方法求LD50，然后再设计剂量分组。LD50的计算方法常用寇氏法、概率单位法、霍思法等。③找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的LD50(LC50)值作为受试化学物的预期毒性中值。急性毒性作用1/9/202017二、急性毒性试验（四）染毒剂量与分组:2．预试验①设定以此预期值作为待测化学物的中间剂量组，并在该剂量的上下各设计l一2个剂量组作为预试验剂量。②根据确定的剂量组进行染毒。③根据预试验的死亡资料确定组距。1/9/202018二、急性毒性试验（四）染毒剂量与分组:3．正式试验;一般来说、根据试验设计所选用的LD50计算方法来确定组数。急性毒性作用1/9/202019二、急性毒性试验（五）试验周期与毒效应观察1.中毒症状1/9/202020二、急性毒性试验（五）试验周期与毒效应观察:2.体重在观察试验动物中毒症状的过程中，应同时观察体重的变化。体重可以反映动物中毒后的整体变化。体重改变的原因很多，若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食减少甚至拒食，表现为体重减轻。若化学毒物引起腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也会减轻。如果化学毒物影响水的摄取或肾功能急性损伤，也可能在体重上反映出来。所以，对存活动物尤其是对低于LD50剂量组的存活动物．应在观察期14天内称量其体重的变化．以便了解受试物引起毒效应的持续时间。急性毒性作用1/9/202021二、急性毒性试验（五）试验周期与毒效应观察:3.病理检查及其他指标:急性毒性试验中，对死亡的动物均应及时进行大体解剖和病理组织学检查，肉眼观察主要脏器的大体病理变化，如脏器大小、外观、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其它改变，对有改变的脏器进行取材做组织病理学检查。对存活动物在观察期结束时进行大体病理检查．必要时做组织病理学检查。根据试验需要可进一步扩大观察项目．如体温、心电图、脑电图或进行某些生化指标测定等。急性毒性作用1/9/202022二、急性毒性试验（五）试验周期与毒效应观察4.死亡和死亡时间重点观察和记录每只动物死亡的时间，特别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组动物的死亡数。分析中毒死亡时间的规律具有一定意义，可为深人研究化学物的毒作用机制提供参考。急性毒性作用1/9/202023LD50的计算方法改进寇氏法霍恩法序贯法Bliss法1/9/202024改进寇氏法是利用计量对数与死亡率呈S型曲线而设计的方法，又称平均致死量法。本法要求每个染毒剂量组动物数要相同，各剂量组组距呈等比级数，死亡率呈正态分布，最低剂量组死亡率20%，最高剂量组80%。1/9/202025计算公式如下：M=Xk-i(∑p-0.5)Sm=i(∑pq/n)1/2M:㏒LD50i：相邻两剂量组之对数差值Xk：最大剂量的对数值；q：存活率∑p：各组死亡率之和;n:每组动物数1/9/202026组别剂量对数动物数死亡数11.176110021.256110231.336110541.416110751.49611091/9/202027M=Xk-i(∑p-0.5)=1.4961-0.08（2.3-0.5）Sm=i(∑pq/n)1/2=0.08（0.16/10+0.25/10+0.21/10+0.09/10）1/21/9/202028霍恩法利用剂量对数与死亡率的转换数呈直线关系而设计的方法，又称平均移动法或剂量递增法。该法使用动物数少，可直接查表求出LD50。该法推荐使用4个染毒剂量，要求每组动物数相等，一般用4-5只动物，且剂量组按等比级数排列。1/9/202029序贯法又称平均数法、阶梯法或上-下法，先以一个剂量进行实验，若动物死亡，则以下一个较小剂量试探；若动物存活，则以较大剂量试探，依次类推，最终求出LD50。1/9/202030LD50=(∑xf)/nn:使用的动物总数；X：每个剂量组的剂量f:每个剂量组使用动物数1/9/202031举例：小鼠经口给与某化学物染毒，10mg/kg剂量试探，预计使用4个剂量组，剂量组距对数值0.2，设计使用12只动物，结果如下剂量存活死亡12.590210.00237.94226.31101/9/202032∑xf=12.59×2+10×5+7.94×4+6.31×1该法优点是节省动物，一般12-14只左右动物即可完成实验。缺点？1/9/202033二、急性毒性试验(六)经典急性毒性试验的局限性1.消耗的动物量大2.获得的信息有限3.测得的LD50仅仅是一个近似值4.在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。急性毒性作用1/9/202034三、急性毒性评价外源化学物急性毒性分级（WHO）毒性分级大鼠一次经口LD50(mg/kg)6只大鼠吸入4小时，死亡2~4只的浓度(ppm)兔经皮LD50(/mg/kg)对人可能致死的估计量g/kg总量(g/60kg)剧毒11050.050.1高毒1~10~5~0.05~3中等毒50~100~44~0.5~30低毒500~1000~350~5~250实际无毒5000~10000~2180~151000急性毒性作用1/9/202035三、急性毒性评价我国食品毒理急性毒性分级法(1994)急性毒性分级大鼠经口LD50(mg/kg)大致相当于70kg人的致死量6级(极毒)1稍尝,7滴5级(剧毒)1~507滴~1茶匙4级(中等毒)51~5001茶匙~35克3级(低毒)501~500035~350克2级(实际无毒)5001~15000350~1050克1级(无毒)150001050克急性毒性作用1/9/202036一、基本概念二、蓄积毒性试验方法及其评价蓄积作用及其评价§2蓄积毒性1/9/202037化学毒物进入机体后，经过生物转化以代谢产物或化学物原型排出体外。但是，当化学毒物反复多次给动物染毒，化学毒物进入机体的速度(或总量)超过代谢转化的速度和排泄的速度(或总量)时，化学毒物或其代谢产物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学毒物的蓄积作用(accumulation)。一、基本概念1/9/202038某些毒物多次以小剂量反复进入体内，可表现出机体对该毒物的反应性增强，即一次染毒不引起反应的剂量，如多次重复染毒，则可能引起明显的反应甚至死亡。毒物的蓄积与进入机体的毒物剂量、重复染毒的间隔时间、毒性及代谢特点和机体反应特性条件有关。1/9/202039蓄积作用实际上有二个含义：物质蓄积(materialaccumulation)功能蓄积(functionalaccumulation)蓄积作用及其评价一、基本概念1/9/202040物质蓄积：实验动物反复多次接触化学物后，用化学分析方法能够检测到机体内存在该化学物或代谢产物功能（机能）蓄积：有的化学物在长期接触后，机体内虽不能检测到机体内存在该化学物或代谢产物，却出现了慢性毒性作用。1/9/202041功能蓄积可能是由于机体内的化学物或其代谢产物的数量极微，不能检测出物质的蓄积或者是由于每次机体接触化学物后所引起的损害累积所致1/9/202042蓄积作用的检测方法应用化学分析或其他技